非多重耐藥及多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵及其表達(dá)

劉澤世，呼 瑞，張 毅，陳正立，耿 燕，薛 麗

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710004；2. 西北婦女兒童醫(yī)院

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◇臨床研究◇

非多重耐藥及多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌外排泵及其表達(dá)

劉澤世1，呼 瑞2，張 毅1，陳正立3，耿 燕1，薛 麗1

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西西安 710004；2. 西北婦女兒童醫(yī)院

婦產(chǎn)科重癥監(jiān)護(hù)室，陜西西安 710061；3. 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北石家莊 050031)

目的 探討多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug resistantAcinetobacterbaumannii, MDRAB)及非多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(non-multidrug resistantAcinetobacterbaumannii, N-MDRAB)的外排泵表型、基因型和外排泵基因表達(dá)情況。方法 應(yīng)用K-B法將120株臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌，分成MDRAB 96株和N-MDRAB 24株兩組；參照Sylvia Valdezate方法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的外排泵表型，即采用微量肉湯稀釋法，觀察加入泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)前后其MIC值的變化，篩選出加入泵抑制劑后MIC值比原值降低1/4倍或以上的菌株為AB外排泵表型陽(yáng)性；PCR法擴(kuò)增外排泵蛋白基因并測(cè)序進(jìn)行序列分析。結(jié)果 96株MDRAB對(duì)β-內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、多黏菌素類抗菌藥物的耐藥率分別為76.04%～92.71%、73.96%～97.92%、40.63%～42.71%、92.71%～98.96%、93.75%～98.96%、98.96%、79.17%、0。24株N-MDRAB對(duì)頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、多黏菌素類抗菌藥物的耐藥率分別為16.52%～20.43%、11.22%～15.65%、0、17.83%～18.26%、20.43%～23.39%、14.78%、19.57%、0。外排泵抑制檢測(cè)結(jié)果顯示，96株MDRAB有34株外排泵陽(yáng)性，外排泵基因檢測(cè)有33株adeB、32株adeR、33株adeS、33株adeJ、0株adeE和33株abeM，檢出陽(yáng)性率分別為97.06%、94.12%、97.06%、97.06%、0、97.06%； 24株N-MDRAB未檢測(cè)到外排泵陽(yáng)性菌株，但外排泵基因檢測(cè)有12株adeB、20株adeR、16株adeS、18株adeJ、0株adeE和16株abeM，檢出陽(yáng)性率分別為50%、83.33%、66.67%、75%、0、66.67%。對(duì)adeB、adeR、adeS、adeJ、abeM基因進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)比對(duì),所測(cè)序列與GenBank中序列同源性為100%。結(jié)論 外排泵基因廣泛存在于MDRAB中，但在N-MDRAB中亦可以發(fā)現(xiàn)主動(dòng)外排泵基因的存在。

鮑曼不動(dòng)桿菌；多重耐藥；外排泵；羰基氰氯苯腙；基因型；表型

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii, Ab)是一種臨床常見(jiàn)的非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，其可以廣泛分布于醫(yī)院環(huán)境、醫(yī)務(wù)人員和患者的皮膚表面，屬于常見(jiàn)的院內(nèi)感染條件致病菌[1]。近年來(lái)隨著免疫抑制劑、廣譜抗生素的廣泛使用和侵入性的醫(yī)療操作的常規(guī)開(kāi)展，使Ab的感染率呈逐年上升的趨勢(shì)[2-3]?！吨袊?guó)鮑曼不動(dòng)桿菌感染與防控專家共識(shí)》將多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(multidrug resistantAcinetobacterbaumannii, MDRAB)定義為對(duì)5類抗菌藥物中至少3類抗菌藥物耐藥的菌株，其中包括: 含有β內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑(包括哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、氨芐西林/舒巴坦) 、抗假單胞菌碳青霉烯類抗生素、抗假單胞菌頭孢菌素、氨基糖苷類抗生素、氟喹諾酮類抗菌藥物[4]。筆者以往研究表明，在體外實(shí)驗(yàn)中外排泵的存在使Ab對(duì)頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、氨基糖苷類、喹諾酮類、四環(huán)素類、磺胺類、多黏菌素類等抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥；而在體外實(shí)驗(yàn)中加入泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)后，泵抑制劑與外排泵相互作用，通過(guò)逆轉(zhuǎn)質(zhì)子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，提高藥物對(duì)MDR-AB的抗菌活性[5]。MARCHAND[6]和CHAU[7]發(fā)現(xiàn)外排泵基因adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM與Ab的耐藥密切相關(guān)。但是，目前尚無(wú)明確研究表明非多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌(non-multidrug resistantAcinetobacterbaumannii, N-MDRAB)是否存在有上述外排泵基因的表達(dá)。本研究通過(guò)對(duì)MDRAB及N-MDRAB表型和基因型檢測(cè)，探討外排泵對(duì)Ab耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 藥敏紙片：哌拉西林(PIP，100 μg/片)、亞胺培南(IPM，10 μg/片)、阿米卡星(AK，30 μg/片)、慶大霉素(GEN，10 μg/片)、氨芐西林/舒巴坦(SAM，10/10 μg/片)、環(huán)丙沙星(CIP，5 μg/片)、復(fù)方新諾明(SXT，23.75 μg/片)、頭孢吡肟(CPR，30 μg/片)、頭孢曲松(CRO，30 μg/片)、四環(huán)素(TC，30 μg/片)、多黏菌素B(PMB，300 IU/片)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF，75/10 μg/片)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP，100/10 μg/片)、美羅培南(MRP，10 μg/片)、左氧氟沙星(LEV，5 μg/片)、頭孢噻肟(CTX，30 μg/片)。法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品陰性桿菌的GN鑒定卡。英國(guó)OXID公司的K-B法藥敏紙片。大腸埃希菌ATCC25922及鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606為質(zhì)控菌株。購(gòu)自Promega公司Maxwell?16 Cell LEV DNA Purification Kit試劑盒提取DNA，購(gòu)自美國(guó)Promega公司GoTaq?Green Master Mix、GoTaq?Colorless Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，購(gòu)自北京賽百盛公司Goldview進(jìn)行DNA染色劑，購(gòu)自北京賽百盛公司的DNA Ladder Marker 100 bp，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的瓊脂糖X-gal。羰基氰氯苯腙(CCCP)和泵抑制劑溶解試劑二甲亞砜均購(gòu)于河北博世林公司。

1.2 菌株來(lái)源與保存 2014年4月至2015年3月從河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院和西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院分離到的不重復(fù)菌株120株作為實(shí)驗(yàn)菌株。標(biāo)本類型包括痰液、分泌物、尿液、血液、膿液、引流物(胸腹水)。使用MH培養(yǎng)基將收集的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，待增菌后，將增菌液與50%甘油肉湯1∶1混勻，置于-70 ℃冰箱保存。

1.3 細(xì)菌鑒定 根據(jù)臨床分離的120株不重復(fù)菌株的菌落形態(tài)和革蘭染色結(jié)果，經(jīng)法國(guó)梅里埃公司Vitek32全自動(dòng)微生物檢測(cè)儀鑒定為Ab。

1.4 藥敏實(shí)驗(yàn) 按照2012年M02-A11臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的Kirby-Bauer法，進(jìn)行哌拉西林、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林/舒巴坦、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、頭孢吡肟、頭孢曲松、四環(huán)素、多黏菌素B、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、美羅培南、左氧氟沙星、頭孢噻肟等17種抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)。對(duì)5類抗菌藥物中至少3類抗菌藥物耐藥的菌株為MDRAB，<3類同時(shí)耐藥的菌株為N-MDRAB。

1.5 Ab外排泵表型的檢測(cè) 應(yīng)用Sylvia Valdezate方法，比較加入CCCP泵抑制劑前后其MIC值的變化，篩選出加入泵抑制劑后MIC值比原值降低1/4倍或以上的Ab菌株。外排泵表型檢測(cè)的抗菌藥物選用四環(huán)素、慶大霉素、頭孢噻肟、左氧氟沙星。具體步驟如下：用分析天平稱取20.48 mg抗菌藥物溶解于4 mL的無(wú)菌生理鹽水，使其原液的質(zhì)量濃度為5 120 μg/mL。取12只無(wú)菌試管，第1個(gè)無(wú)菌試管加入1.6 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯以及0.4 mL抗菌藥物原液，其余無(wú)菌試管加入1 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯。將第1個(gè)無(wú)菌試管中液體混勻后吸取1 mL加入第2管，混勻再吸取1 mL加入第3管，依次倍比稀釋至第11管，再吸取第11管中1 mL混合物棄去，第12管為陽(yáng)性對(duì)照(不含抗菌藥物)。這樣第1管至第11管的藥物質(zhì)量濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/mL。從每個(gè)無(wú)菌管中取100 μL抗菌液加入至96孔微量肉湯藥敏板中。用分析天平準(zhǔn)確稱取4 mg CCCP粉劑，完全溶解于2 mL 二甲亞砜。取11只無(wú)菌試管，每個(gè)管中加入2 mL 無(wú)菌生理鹽水，再分別向每個(gè)無(wú)菌試管中加入0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05 mL CCCP溶液，此時(shí)質(zhì)量濃度依次為550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50 μg/mL。分別取10 μL CCCP溶液至96孔微量肉湯藥敏板，并同時(shí)每孔加入90 μL菌懸液，此時(shí)，第1孔至第11孔CCCP溶液質(zhì)量濃度分別為55、50、40、35、30、25、20、15、10、5 μg/mL。第12孔作為僅加入菌懸液的陽(yáng)性對(duì)照。最終確定CCCP溶液的工作濃度。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定加入泵抑制劑CCCP后，4種抗菌藥物(四環(huán)素、慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢噻肟)對(duì)96株MDRAB和24株N-MDRAB的MIC值。同時(shí)使用加入泵抑制劑和空白孔作為生長(zhǎng)對(duì)照。對(duì)照管中Ab生長(zhǎng)良好，MIC值為抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物稀釋濃度。參照CLSI 2013年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判讀(單位為μg/mL)。

1.6 目的基因的擴(kuò)增

1.6.1 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)引物，包括adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM和16S RNA，見(jiàn)表1。

表1 外排泵耐藥基因引物Tab.1 The primers of efflux pump drug-resistant genes

1.6.2 DNA提取及擴(kuò)增 使用Maxwell?16 Cell LEV DNA Purification Kit 試劑盒提取DNA，按說(shuō)明書操作。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，其中2×GoTaq?Green Master Mix 12.5 μL，引物A 1.0 μL，引物B 1.0 μL，DNA模板4.0 μL，RNase-free水6.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性50 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.6.3 瓊脂糖凝膠電泳 將配制10×TBE的電泳液稀釋成為0.5×TBE的緩沖液，分別加入8 μL的上樣標(biāo)本量和DNA分子量Maker(100 bp)在電壓100 V作用下，電泳50 min。在紫外凝膠成像系統(tǒng)和全自動(dòng)凝膠圖像成像儀上觀察電泳結(jié)果，陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為凝膠上出現(xiàn)與目的基因片段分子相當(dāng)?shù)臈l帶。

1.6.4 產(chǎn)物核苷酸序列的測(cè)定 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物核苷酸序列測(cè)定，測(cè)得的核苷酸序列應(yīng)用DNAStar軟件中的Editseq和Megalign進(jìn)行分析，參比序列選取正反向雙向測(cè)序結(jié)果一致的序列，比對(duì)序列應(yīng)用BLAST程序。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)均采用細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)中心推行的WHONET統(tǒng)計(jì)軟件和SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。MDRAB及N-MDRAB對(duì)17種抗菌藥物的耐藥率及外排泵基因型表達(dá)陽(yáng)性率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(χ2)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 96株MDRAB和24株N-MDRAB對(duì)17種抗菌藥物的耐藥情況 96株MDRAB對(duì)阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、諾氟沙星、左氧氟沙星、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、頭孢吡肟、頭孢曲松、四環(huán)素等14種抗菌藥物耐藥率在65%以上，對(duì)亞胺培南、美羅培南抗菌藥物耐藥率分別為36.46%、35.42%，對(duì)多黏菌素B無(wú)耐藥發(fā)生；24株N-MDRAB對(duì)阿米卡星、慶大霉素、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、諾氟沙星、左氧氟沙星、頭孢噻肟、復(fù)方新諾明、頭孢吡肟、頭孢曲松、四環(huán)素等14種抗菌藥物耐藥率在13%以下，對(duì)亞胺培南、美羅培南、多黏菌素B抗菌藥物無(wú)耐藥發(fā)生(表2)。

表2 96株MDRAB和24株N-MDRAB對(duì)17種抗菌藥物的耐藥情況Tab.2 Results of drug sensitivity test of 96 MDRAB and 24 N-MDRAB

2.2 抗菌藥物加入外排泵抑制劑CCCP前后的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 96株MDRAB在4種抗菌藥物加入CCCP后，四環(huán)素、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟的MIC范圍分別由32～128、64～128、16～128、64～128變?yōu)?～64、1～128、1～64、8～128(表3)。24株N-MDRAB在4種抗菌藥物加入CCCP后，四環(huán)素、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟的MIC范圍未發(fā)生明顯變化。

2.3 外排泵陽(yáng)性菌株檢出結(jié)果 96株MDRAB在加入泵抑制劑CCCP后，四環(huán)素的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上共有37株，降低2倍的共有8株，沒(méi)有變化的共有51株；左氧氟沙星的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上共有41株，降低2倍的共有12株，沒(méi)有變化的共有43株；慶大霉素的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上共有53株，降低2倍的共有9株，沒(méi)有變化的共有34株；頭孢噻肟的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上共有39株，降低2倍的共有6株，沒(méi)有變化的共有51株。篩選出34株Ab在加入CCCP泵抑制劑后四種抗生素MIC值均降低4倍。24株N-MDRAB未檢測(cè)到外排泵陽(yáng)性菌株。

表3 加入外排泵抑制劑CCCP前后對(duì)96株MDRAB藥物MIC的影響Tab.3 The effect of presence or absence of CCCP on drug sensitivity of 96 MDRAB strains

2.4 34株外排泵陽(yáng)性MDRAB和24株N-MDRAB外排泵基因型的檢測(cè) 34株外排泵MDRAB中外排泵基因檢測(cè)有33株adeB、32株adeR、33株adeS、33株adeJ、0株adeE和33株abeM，檢出陽(yáng)性率分別為97.06%、94.12%、97.06%、97.06%、0、97.06%；24株N-MDRAB外排泵基因檢測(cè)有12株adeB、20株adeR、16株adeS、18株adeJ、0株adeE和16株abeM，檢出陽(yáng)性率分別為50%、83.33%、66.67%、75%、0、66.67%。耐藥基因adeB、adeR、adeS、adeJ、abeM序列與GenBank參考株序列核苷酸同源性均為100%，未發(fā)現(xiàn)基因變異現(xiàn)象(表4)。

表4 34株外排泵陽(yáng)性MDRAB和24株N-MDRAB外排泵基因型檢測(cè)結(jié)果Tab.4 The result of efflux pump genotype of 34 MDRAB and 24 N-MDRAB

3 討 論

近10年來(lái)，Ab已逐步成為引起院內(nèi)感染最重要的機(jī)會(huì)致病菌。Ab在高水平基因組可塑性和內(nèi)源性基因突變的影響下，菌體表面外排泵過(guò)度表達(dá)，排出諸如慶大霉素、氯霉素、喹諾酮類、紅霉素、卡那霉素等藥物。由于藥物無(wú)法進(jìn)入Ab的菌體，故Ab免于藥物的殺滅，繼而形成多重耐藥株[9-11]。引起Ab多重耐藥的主要外排泵包括AdeABC、AdeIJK、AdeDE、AbeM。因此，上述外排泵在N-MDRAB和MDRAB中的作用已逐漸成為Ab是否形成多重耐藥株的關(guān)鍵。

本研究中96株MDRAB和24株N-MDRAB的藥敏結(jié)果顯示，MDRAB頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為76.04%、93.75%、81.25%、65.63%，對(duì)哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為82.29%、77.08%、72.92%，對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為36.46%、35.42%，對(duì)阿米卡星、慶大霉素的耐藥率分別為80.21%、93.75%，對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星的耐藥率分別為88.54%、88.54%、83.33%，對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B的耐藥率分別為92.71%、79.17%、0。N-MDRAB頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為12.50%、12.50%、81.25%、8.33%，對(duì)哌拉西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率分別為8.33%、12.50%、12.50%，對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為0、0，對(duì)阿米卡星、慶大霉素的耐藥率分別為8.33%、12.50%，對(duì)環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氧氟沙星的耐藥率分別為12.50%、8.33%、8.33%，對(duì)四環(huán)素、復(fù)方新諾明、多黏菌素B的耐藥率分別為8.33%、8.33%、0。與何振輝[12]等報(bào)告的藥敏結(jié)果基本一致。

在分子解離狀態(tài)下，CCCP是一種很強(qiáng)的解偶聯(lián)劑，通過(guò)在膜磷脂兩側(cè)自由擴(kuò)散而形成濃度差，這種濃度差可以減慢H+進(jìn)入細(xì)胞膜時(shí)由跨膜電化學(xué)濃度梯度產(chǎn)生的ATP的過(guò)程，ATP的減少使得菌體外排蛋白能量供應(yīng)缺失，外排泵無(wú)法將藥物從菌體內(nèi)泵出至菌體外[13]。本實(shí)驗(yàn)選取了Ab耐藥率最高的4種抗菌藥物：四環(huán)素、左氧氟沙星、慶大霉素、頭孢噻肟作為外排底物，通過(guò)比較加入CCCP泵抑制劑前后，96株MDRAB及24株N-MDRAB對(duì)抗菌藥物MIC的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四環(huán)素MIC值降低4倍及以上共有37株；左氧氟沙星的藥敏結(jié)果中，MIC值降低4倍及以上共有41株；慶大霉素，MIC值降低4倍及以上共有53株；頭孢噻肟MIC值降低4倍及以上共有39株。最終篩選出34株Ab在加入CCCP泵抑制劑后4種抗生素MIC值均降低4倍。24株N-MDRAB未檢測(cè)到外排泵陽(yáng)性菌株。與徐軼等[14]報(bào)道的CCCP逆轉(zhuǎn)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性的趨勢(shì)較為一致。說(shuō)明泵抑制劑CCCP可以體外抑制外排泵，提升藥物對(duì)MDRAB的體外抗菌活性。

本研究對(duì)34株外排泵陽(yáng)性株進(jìn)行外排泵基因檢測(cè)，得到33株adeB、32株adeR、33株adeS、33株adeJ、0株adeE和33株abeM，檢出陽(yáng)性率0～97.06%；本研究中，adeB的出現(xiàn)幾乎伴隨著adeR和adeS的出現(xiàn)，這與MARCHAND等[6]的adeR和adeS協(xié)同參與adeABC的過(guò)度表達(dá)，引起調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，增加耐藥幾率的研究結(jié)果一致。研究中adeJ的存在表明AdeIJK過(guò)度表達(dá)，其可以影響Ab對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物、氯霉素、四環(huán)素、林可霉素、喹諾酮類藥物、新生霉素、利福平的敏感性。同時(shí)AdeIJK、AdeABC協(xié)同參與對(duì)替加環(huán)素的耐藥[15]。研究中未檢測(cè)到adeE的存在，與LIN等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)adeDE存在于Ab基因組3中時(shí)，adeABC無(wú)法與其共同存在與同一株Ab中的結(jié)論一致。研究中abeM的存在，表明abeM外排系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)，其可以引起Ab對(duì)喹諾酮類、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、氯霉素敏感性降低[17]。盡管在24株N-MDRAB未檢測(cè)到外排泵陽(yáng)性菌株的存在，但外排泵基因檢測(cè)有12株adeB、20株adeR、16株adeS、18株adeJ、0株adeE和16株abeM，檢出陽(yáng)性率為0～83.33%。盡管統(tǒng)計(jì)學(xué)表明除adeR之外，其余陽(yáng)性率有明顯差異，但由于在N-MDRAB菌體表面檢測(cè)到有外排泵基因的存在，可以證明雖然主動(dòng)外排泵是Ab發(fā)生耐藥的主要因素，但只單純檢測(cè)Ab是否存在主動(dòng)外排泵基因并不能區(qū)分菌株是否多重耐藥。因此，Ab發(fā)生多重耐藥是否與外排泵基因的表達(dá)水平或與其他耐藥機(jī)制相互作用有關(guān)仍需進(jìn)一步證實(shí)。

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(編輯 卓選鵬)

Relationship between efflux pump and gene expression of non-multidrug resistant and multidrug resistantAcinetobacterbaumannii

LIU Ze-shi1, HU Rui2, ZHANG Yi1, CHEN Zheng-li3, GENG Yan1, XUE Li1

(1. Department of Medical Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2. Department of Intensive Care Unit, Xibei Women and Children’s Hospital, Xi’an 710061; 3. Department of Clinical Laboratory,the First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, China)

Objective To explore the efflux pump phenotype, genotype and gene expressions of multidrugAcinetobacterbaumannii(MDRAB) and non-multidrug resistantAcinetobacterbaumannii(N-MDRAB). Methods K-B method was used to detect 120 strains ofAcinetobacterbaumanniiincluding 96 multidrug resistant strains and 24 non-multidrug resistant strains. We detected efflux pump genotype and gene expressions of multidrug and non-multidrug resistantAcinetobacterbaumanniiwith broth microdilution method by the addition of carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone pump inhibitors with Sylvia Valdezate method. Strains whose MIC decreased to 1/4 or less of the original values were positive ones. Characteristics of efflux pump protein gene sequence were studied by PCR amplification and sequencing. Results TheAcinetobacterbaumanniiresistance rate of 96 strains to cephalosporins, beta-lactams, penicillium carbon alkenes, aminoglycosides, quinolones, tetracyclines, tetracyclines, sulfas, and polymyxins was 73.96%-97.92%, 76.04%-92.71%, 40.63%-42.71%, 92.71%-98.96%, 93.75%-98.96%, 98.96%, 79.17%, and 0. TheAcinetobacterbaumanniiresistance rate of 24 strains was 16.52%-20.43%, 11.22%-15.65%, 0, 17.83%-18.26%, 20.43%-23.39%, 14.78%, 19.57%, and 0. There were 34 positive efflux pump phenotypes in 96 multidrug resistantAcinetobacterbaumanniistrains, including 33 adeB strains, 32 adeR strains, 33 adeS strains, 33 adeJ strains, 0 adeE strains, 33 abeMstrains, with positive detection rate of 97.06%, 94.12%, 97.06%, 97.06%, 0, and 97.06%, respectively. Positive efflux pump phenotype was not detected in 24 multidrug resistantAcinetobacterbaumanniistrains, but in 12 adeB strains, 20 adeR strains,16 adeS strains,18 adeJ strains, 0 adeE strains, and 16 abeM strains, with a positive detection rate of 50%, 83.33%, 66.67%, 75%, 0, and 66.67%, respectively. By sequence comparison, the sequence homology of adeB, adeR, adeS, adeJ, and abeM genes was 100% in the Genbank. Conclusion The efflux pump genes exist both in multidrug and non-multidrug resistantAcinetobacterbaumannii.

Acinetobacterbaumannii; multidrug resistance; efflux pump; carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone; genotype; phenotype

2016-01-09

2016-04-19

耿燕. E-mail: wsw87679358@163.com

R378.99

A

10.7652/jdyxb201606009

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1814.014.html(2016-10-10)