大氣壓低溫等離子體處理BALB/c小鼠的安全性研究

董穎穎，鐘世玉，夏 君，劉定新，許德暉，郭 莉，肖生祥，孔剛玉

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710004；2. 西安交通大學(xué)電氣工程學(xué)院，陜西西安 710049)

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◇基礎(chǔ)研究◇

大氣壓低溫等離子體處理BALB/c小鼠的安全性研究

董穎穎1，鐘世玉1，夏 君1，劉定新2，許德暉2，郭 莉2，肖生祥1，孔剛玉2

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，陜西西安 710004；2. 西安交通大學(xué)電氣工程學(xué)院，陜西西安 710049)

目的 使用大氣壓低溫等離子(CAP)體處理BALB/c小鼠背部皮膚，驗證CAP物理治療對活體的安全性。方法 CAP每日照射小鼠背部皮膚3 min，連續(xù)2周；檢測處理組及對照組血常規(guī)及生化指標(biāo)；測定小鼠臟器系數(shù)；對小鼠皮膚及臟器進(jìn)行HE染色；測定小鼠精子活率及畸形率。結(jié)果 處理后小鼠背部皮膚及HE染色均未見異常；CAP處理組小鼠相比于對照組小鼠，在體質(zhì)量、各臟器質(zhì)量及各臟器系數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異；CAP處理組小鼠的血常規(guī)指標(biāo)及生化指標(biāo)較對照組均未見明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；兩組小鼠的內(nèi)臟大體外觀形態(tài)正常，組間比較無明顯差異；CAP處理組小鼠各內(nèi)臟組織學(xué)觀察較正常對照組未見明顯異常改變；兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。小鼠精子活率及畸形率兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異，CAP處理對雄性小鼠精子畸形無明顯影響。結(jié)論 CAP處理對小鼠皮膚及各臟器無毒性作用，不產(chǎn)生生殖毒性，臨床使用安全。

大氣壓低溫等離子體；安全性；生化指標(biāo)；臟器系數(shù)；精子畸形率

大氣壓低溫等離子體(cold atmospheric plasma, CAP)是包含自由基等活性粒子的物質(zhì)第四態(tài)，近年被證實對機體與細(xì)胞有諸多生物學(xué)效應(yīng)。CAP應(yīng)用于消毒滅菌方面已非常成熟，既能高效滅活病原微生物，并同時保持較低的細(xì)胞毒性[1-2]。目前，CAP又被應(yīng)用于促進(jìn)慢性感染性傷口的愈合、抗腫瘤及銀屑病治療等相關(guān)研究[3-5]。作為醫(yī)學(xué)應(yīng)用的前提，等離子體處理對活體組織的安全性必須得到保證。本研究內(nèi)容以BALB/c小鼠為實驗對象，觀察CAP裝置對小鼠處理過程中及處理結(jié)束后的安全性，對血常規(guī)、生化指標(biāo)及臟器系數(shù)、精子活率及畸形率等指標(biāo)進(jìn)行測定，為該CAP裝置的臨床應(yīng)用提供安全性數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物與儀器 SPF級BALB/c小鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心?？諝庵醒孛娣烹姷蜏氐入x子體裝置由西安交通大學(xué)電氣學(xué)院等離子體生物醫(yī)學(xué)中心制作并提供。

1.2 BALB/c小鼠的飼養(yǎng) 選用6周齡，體質(zhì)量18～20 g的雌鼠20只、雄鼠40只，飼養(yǎng)于清潔級動物飼養(yǎng)室內(nèi)。飼養(yǎng)過程中注意觀察小鼠運動、攝食、排泄等生活習(xí)性的改變以及體質(zhì)量增加的情況等。

1.3 實驗分組與處理 將40只雄鼠、20只雌鼠隨機分為兩組，一組為對照組，雌10只雄20只，一組為CAP處理組，雌10只雄20只，兩組小鼠的體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異；將小鼠背部毛剃除，脫毛膏脫去表面毳毛，表面涂抹保濕劑，備用。可重復(fù)脫毛1～2次。將小鼠固定，將CAP裝置調(diào)整放電電極距離小鼠背部約1 cm。裝置工作條件Vpp=10 kV，f=10 kHz，處理時間3 min，每日1次。整個處理過程連續(xù)進(jìn)行2周。每日觀察照射處皮膚變化，并拍照，同時稱體質(zhì)量；對照組小鼠不予任何處理。

1.4 小鼠血常規(guī)及生化指標(biāo)的檢測 用眼球取血的方法進(jìn)行采血，將采集血液送檢，測定血常規(guī)及生化指標(biāo)。

1.5 小鼠臟器系數(shù)檢測 對頸椎脫臼法處死后的小鼠進(jìn)行解剖，分離小鼠心臟、雙肺、肝臟、脾臟、雙腎、睪丸及附睪，觀察外觀形態(tài)，稱其質(zhì)量，計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 小鼠皮膚及臟器HE染色 處死小鼠后取照射部皮膚，和內(nèi)臟進(jìn)行標(biāo)本固定后制作石蠟切片，行HE染色，觀察皮膚及各臟器鏡下結(jié)構(gòu)的情況。

1.7 小鼠精子活率及畸形率的測定 CAP處理過程結(jié)束后，實驗組及對照組中剩余10只雄鼠繼續(xù)飼養(yǎng)4周，進(jìn)行精子活率及畸形率的測定。按照精子的運動方式情況可分為4級：Ⅰ級精子活動很好，快速向前運動；Ⅱ級精子活動好，緩慢向前運動；Ⅲ級精子活動力一般，曲線運動；Ⅳ級精子活動能力差，原地運動或不動。計算樣本中精子活率=(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ)×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨立樣本t檢驗方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠皮膚形態(tài)及組織病理改變 對照組小鼠背部皮膚光滑，正常皮膚光澤(圖1A)。處理組小鼠背部皮膚未見明顯異常，無紅斑、鱗屑、滲出、潰瘍等改變(圖1B)，HE染色示小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整，未見異常改變，與對照組小鼠比較無差異(圖1C、1D)。因此，本實驗中CAP裝置在設(shè)定工作參數(shù)狀態(tài)下對小鼠皮膚進(jìn)行處理，不會引起皮膚灼傷或其他刺激性改變。

圖1 小鼠皮膚形態(tài)及組織病理改變Fig.1 The changes of skin morphology and histopathology in the mice (HE, ×200)

2.2 小鼠體質(zhì)量及臟器系數(shù)的比較 CAP處理組小鼠相比于對照組小鼠，在體質(zhì)量、各臟器質(zhì)量及各臟器系數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異。2周的CAP處理未對小鼠體質(zhì)量、各臟器質(zhì)量產(chǎn)生影響(表1)。

2.3 小鼠血常規(guī)及生化指標(biāo)的比較 CAP處理組小鼠間的血常規(guī)指標(biāo)及生化指標(biāo)較對照組均未見明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，2周的CAP處理未對小鼠的血常規(guī)指標(biāo)及生化指標(biāo)產(chǎn)生影響(表2、表3)。

表1 兩組小鼠體質(zhì)量、臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)的比較Tab.1 Comparison of body and organs weights and organ indexes of the mice

表2 兩組小鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較Tab.2 Comparison of blood routine indexes of the mice

表3 兩組小鼠生化指標(biāo)的比較Tab.3 Comparison of biochemical parameters of the mice

2.4 小鼠臟器形態(tài)及組織病理改變 兩組小鼠臟器在剝離時均無異常粘連，分離后均形態(tài)完整、規(guī)則，表面光滑有正常光澤，未見水腫或萎縮等肉眼可見的外觀改變，組間比較無明顯差異(圖2)。HE染色兩組鼠的心臟切片中可見完整的心內(nèi)膜、心肌層及心外膜結(jié)構(gòu)，心肌層由形態(tài)規(guī)則、排列整齊的心肌纖維構(gòu)成(圖3A、3B)；肝臟形態(tài)規(guī)則、緊密相鄰的肝細(xì)胞，小葉間結(jié)締組織中可見小葉間靜脈及單層立方上皮圍成的小葉間膽管(圖3C、3D)；脾臟可見白髓與紅髓構(gòu)成的脾髓結(jié)構(gòu)，脾小結(jié)中央可見中央動脈；肺臟可見大量扁平有核上皮形成的肺泡及肺泡囊、肺泡管結(jié)構(gòu)，可見無纖毛方形上皮形成的終末細(xì)支氣管，外層由平滑肌包繞，附近可見血管結(jié)構(gòu)；腎臟切片中皮質(zhì)區(qū)可見豐富的腎小球結(jié)構(gòu)(圖3E、3F)；小腸切片中黏膜層可見大量腸絨毛(圖3G、3H)；睪丸切片中可見大量圓形、規(guī)則的曲細(xì)精管，其內(nèi)可觀察到形態(tài)規(guī)則的各級生精細(xì)胞，可見支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞形成的間質(zhì)結(jié)構(gòu)。CAP處理組小鼠各內(nèi)臟組織學(xué)觀察較正常對照組未見明顯異常改變。

圖2 小鼠臟器形態(tài)的比較Fig.2 Comparison of organ morphology of the mice

圖3 小鼠各臟器組織病理的比較Fig.3 Comparison of the organs’ histopathologic findings of the mice (HE, ×200)

2.5 小鼠精子活率及畸形率的比較 正常組小鼠的精子活率為(63.70±4.43)%，CAP處理組小鼠的精子活率為(65.20±3.32)%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組數(shù)據(jù)無顯著性差異(表4)。CAP處理對雄性小鼠精子活率無明顯影響。小鼠精子形態(tài)和活動度在鏡下兩組無明顯差別(圖4)。經(jīng)計算，正常對照組小鼠的精子畸形率為(2.90±0.19)%，CAP處理組小鼠的精子畸形率為(3.10±0.23)%，兩組數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異。因此，CAP處理對雄性小鼠精子畸形率無明顯影響。

表4 小鼠精子活率和畸形率的比較Tab.4 Comparison of the ratios of sperm activity and deformity of the mice

圖4 雄鼠正常精子形態(tài)的比較Fig.4 The morphology of the eupyrene sperm of the male mice

3 討 論

CAP是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)中的一個新的研究領(lǐng)域，由于各研究團(tuán)隊中應(yīng)用的CAP裝置的結(jié)構(gòu)設(shè)計、等離子體產(chǎn)生方式等參數(shù)不盡相同，且當(dāng)前對CAP裝置本身工作參數(shù)設(shè)定及安全性標(biāo)準(zhǔn)尚未有統(tǒng)一的規(guī)范化管理標(biāo)準(zhǔn)，因此，根據(jù)生物醫(yī)學(xué)研究的具體處理對象及實驗?zāi)康模瑢AP裝置使用的安全性進(jìn)行測定。當(dāng)前使用的CAP裝置的安全性評價還沒有規(guī)范的檢測標(biāo)準(zhǔn)或明確的檢測方法[6-8]。除了對等離子體本身包含的可能的有害成分，如UV等進(jìn)行測定外，還需對被處理物的生物學(xué)反應(yīng)及對處理的耐受性進(jìn)行評價[9]。本研究采用BALB/c小鼠作為處理對象，觀察了空氣中沿面放電等離子體裝置每日連續(xù)處理對小鼠處理部位皮膚、各組織器官結(jié)構(gòu)、血液生化指標(biāo)及雄鼠精液的影響[10-12]。

本研究中使用SMD結(jié)構(gòu)的CAP裝置(工作參數(shù)等同前)每日對BALB/c小鼠進(jìn)行3 min的處理，共連續(xù)處理2周時間。由于小鼠背部被處理部位的皮膚結(jié)構(gòu)與裝置放電電極距離最近，皮膚結(jié)構(gòu)的改變直接反映了處理劑量的高低水平。通過皮膚組織病理切片可見，處理組小鼠與正常小鼠的皮膚組織結(jié)構(gòu)相同，未見明顯異常。ISBARY等[13]采用類似結(jié)構(gòu)的CAP裝置對志愿者皮膚進(jìn)行處理，裝置能量密度為0.02 W/cm2，單次處理時間為300 s，連續(xù)的2～4次處理后取皮膚進(jìn)行組織病理學(xué)切片及電鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)皮膚組織結(jié)構(gòu)的明顯變化。本研究中裝置的能量密度為0.06 W/cm2，BALB/c小鼠接受的單次處理劑量及整體處理時間均超過ISBARY等[13]實驗中參數(shù)，同樣沒有觀察到皮膚組織結(jié)構(gòu)的改變。對BALB/c小鼠的體質(zhì)量及各臟器系數(shù)進(jìn)行了記錄分析，發(fā)現(xiàn)處理組小鼠與對照組小鼠的各項指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異，說明在研究中設(shè)定的工作條件下，CAP處理未對小鼠的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，對各臟器無明顯毒性。小鼠的血常規(guī)及生化指標(biāo)亦未見異常，CAP處理不會引起小鼠血常規(guī)及生化代謝的改變。

CAP對皮膚組織進(jìn)行處理的操作方法與UV、紅外線等物理輻射治療手段類似，因此需要了解CAP處理對被處理對象生殖系統(tǒng)的影響[14-15]。本研究中對雄鼠的睪丸及附睪進(jìn)行觀察，對精子活率及畸形率進(jìn)行測定，結(jié)果顯示CAP處理組小鼠的睪丸及附睪未見異常，精子活率及畸形率與對照組正常小鼠無顯著差異，CAP處理組小鼠附睪的生精能力未受影響，說明CAP處理不會對雄鼠產(chǎn)生生殖毒性。

本研究通過動物實驗對CAP裝置的安全性進(jìn)行了初步的評估，未發(fā)現(xiàn)CAP處理對小鼠皮膚及各臟器的毒性作用。今后的實驗中可通過相對微觀且更為細(xì)致的指標(biāo)或方法[16]，在基因或蛋白水平對CAP裝置的安全性進(jìn)行更為深入的觀察研究。

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(編輯 韓維棟)

The safety of cold atmospheric plasma treatment on BALB/c mice

DONG Ying-ying1, ZHONG Shi-yu1, XIA Jun1, LIU Ding-xin2,XU De-hui2, GUO Li2, XIAO Sheng-xiang1, KONG Gang-yu2

(1. Department of Dermatology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2. School of Electrical Engineering,Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710049, China)

Objective To evaluate the biological safety of cold atmospheric plasma (CAP) treatment on the dorsal skin of BALB/c mice. Methods The dorsal skin of BALB/c mice was irradiated daily by three-minute CAP for two weeks. Both routine blood test and biochemical analysis were performed during this period. The indexes of internal organs were scored, followed by hematoxylin-eosin (HE) staining of these tissues and dorsal skin. The ratios of sperm activity and deformity were also calculated. Results After CAP treatment, the dorsal skin and H&E staining showed normal appearance. Compared with the controls, the mice in treatment group had the same weights and indexes of body and organs (P>0.05). Moreover, CAP did not affect the blood routine indexes or biochemical parameters (P>0.05). The two groups displayed similar optical and histological appearance of these internal organs. Furthermore, the two groups did not differ significantly in the ratios of sperm activity or deformity (P>0.05). Conclusion CAP treatment has clinical safety by exhibiting neither routine toxicity on the skin and internal organs nor genotoxicity on male reproductive system of BALB/c mice.

cold atmospheric plasma; safety; biochemical parameter; index of organ; ratio of sperm deformity

2016-05-12

2016-08-06

西安交通大學(xué)千人計劃項目(No.2014-09)；國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81601630)；陜西省自然科學(xué)基金青年人才項目(No.2016JQ8044)

Supported by the Thousands of People Plan of Xi’an Jiaotong University (No.2014-09), the National Natural Science Foundation of China (No.81601630), and the Natural Science Foundation of Shaanxi Province (No.2016JQ8044)

董穎穎. E-mail:dyingying97@163.com

R332

A

10.7652/jdyxb201606008

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161012.1607.016.html(2016-10-12)