高糖狀態(tài)對(duì)胰腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的促進(jìn)作用

黎 韡，徐勤鴻，馬清涌

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061)

?

◇基礎(chǔ)研究◇

高糖狀態(tài)對(duì)胰腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的促進(jìn)作用

黎 韡，徐勤鴻，馬清涌

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安 710061)

目的 研究高濃度葡萄糖對(duì)胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3活性氧(ROS)及抗氧化酶水平的影響。方法 用DCFH-DA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞ROS水平；用過氧化氫(H2O2)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)H2O2水平；用不同抗氧化酶試劑盒檢測(cè)細(xì)胞中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性；用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中SOD1和SOD2蛋白水平表達(dá)；通過siRNA技術(shù)下調(diào)SOD2的表達(dá)，研究H2O2的生成與SOD的關(guān)系。結(jié)果 胰腺癌細(xì)胞在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平及H2O2水平明顯升高，并呈現(xiàn)濃度依賴性(P<0.05),甘露醇對(duì)氧化應(yīng)激水平無明顯影響；高糖狀態(tài)可以明顯提高細(xì)胞中T-SOD及CAT活性(P<0.05)，而對(duì)GPX活性無明顯影響；與正常濃度葡萄糖組相比，高濃度葡萄糖可明顯升高細(xì)胞SOD2蛋白表達(dá)水平，而對(duì)SOD1蛋白表達(dá)無明顯影響；siRNA組SOD2蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，下調(diào)SOD2表達(dá)可明顯降低高糖狀態(tài)所調(diào)控的H2O2水平。結(jié)論 高濃度葡萄糖可明顯提高胰腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，H2O2的產(chǎn)生與SOD2的升高存在一定聯(lián)系。

高糖；活性氧；過氧化氫；超氧化物歧化酶；胰腺癌

胰腺癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，由于其早期缺乏明顯的癥狀及診斷水平的局限性，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于不可逆轉(zhuǎn)的晚期。因此，胰腺癌生物學(xué)行為的研究對(duì)疾病的治療及預(yù)后尤為關(guān)鍵。氧化應(yīng)激是機(jī)體活性氧(ROS)與抗氧化物質(zhì)的一種失衡狀態(tài)。ROS是由氧氣所衍生的多種化學(xué)活性分子的統(tǒng)稱，其主要包括超氧陰離子、過氧化氫(H2O2)及羥自由基等。當(dāng)ROS水平超過抗氧化物的調(diào)節(jié)能力時(shí)，機(jī)體處于氧應(yīng)激狀態(tài)。ROS對(duì)腫瘤存在正反兩方面影響：高濃度ROS可誘發(fā)腫瘤凋亡，抑制腫瘤增殖；當(dāng)ROS不足以殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，其可參與腫瘤基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。機(jī)體抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)。

糖尿病是以高血糖為特征的慢性疾病，其發(fā)病機(jī)制與胰島素分泌相對(duì)不足及胰島素抵抗相關(guān)。糖尿病不僅是胰腺癌的重要促進(jìn)因素和危險(xiǎn)因素，也是胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素。85%的胰腺癌患者存在不同程度的糖耐量異常甚或存在糖尿??；50%的胰腺癌患者在確診時(shí)發(fā)現(xiàn)合并有糖尿病，其中半數(shù)糖尿病患者屬于新發(fā)糖尿病[2]。本研究選用人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株，通過不同葡萄糖濃度培養(yǎng)基干預(yù)，觀察細(xì)胞ROS及抗氧化酶水平的變化，從新的角度探討胰腺癌與糖尿病之間的關(guān)系，揭示高糖狀態(tài)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人胰腺癌細(xì)胞BxPC-3購于美國ATCC；DMEM(低糖型，美國GIBCO公司)；葡萄糖(美國Sigma公司)；胎牛血清(美國HyClone公司)；ROS檢測(cè)試劑盒、H2O2檢測(cè)試劑盒、CAT檢測(cè)試劑盒、GPX檢測(cè)試劑盒、T-SOD活性檢測(cè)試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；小干擾RNA合成(si-SOD2)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；SOD1、SOD2抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BxPC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液中，置于含50 mL/L CO2、37 ℃恒溫飽濕培養(yǎng)箱中，1～2 d更換新鮮培養(yǎng)基一次，當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞中ROS含量的測(cè)定 將貼壁生長(zhǎng)的BxPC-3消化、離心后重懸，按每孔6×105加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入不同干預(yù)因素，置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用培養(yǎng)基(無血清)按照1∶1 000稀釋DCFH-DA，終濃度10 μmol/L。去除待檢測(cè)細(xì)胞中的培養(yǎng)液，加入稀釋好的DCFH-DA(1 mL/孔)。在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育15～20 min，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌、并應(yīng)用胰酶消化細(xì)胞后，無血清培養(yǎng)基重懸。待測(cè)樣本采用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)、525 nm發(fā)射波長(zhǎng)于流式細(xì)胞儀下檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞中H2O2含量的測(cè)定 將BxPC-3細(xì)胞收集到離心管內(nèi)，棄上清液，按照1×106個(gè)細(xì)胞加入100 μL H2O2檢測(cè)裂解液的比例置入細(xì)胞裂解液，隨后充分勻漿并裂解細(xì)胞，低溫離心機(jī)離心后留取上清液后續(xù)測(cè)定。稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、25、50、100、200、400 μL)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入50 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，并加入100 μL H2O2檢測(cè)試劑。酶標(biāo)儀測(cè)定A560，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中H2O2的濃度。

過濾器技術(shù)可以屏蔽不良的網(wǎng)站，對(duì)網(wǎng)上色情、暴力和賭博等內(nèi)容有強(qiáng)大的堵截功能。防火墻技術(shù)可以有效地將內(nèi)部網(wǎng)與外部網(wǎng)隔離開來，保護(hù)網(wǎng)絡(luò)不受未經(jīng)授權(quán)的第三方侵入。

濕式誘捕器投放高度20、40、60 cm處理誘捕茶尺蠖成蟲總量分別為321、158和148頭，平均每臺(tái)為 80.25、39.50 和 37.00 頭，可見高度 20 cm 處理誘捕量最多，并與其他2個(gè)處理均達(dá)到顯著差異，高度40和60 cm處理誘捕效果相當(dāng)，因此，濕式誘捕器在茶園的最優(yōu)投放高度為20 cm。

1.2.4 細(xì)胞中T-SOD活性的檢測(cè) 用細(xì)胞裂解液按照每1×106個(gè)細(xì)胞加入200 μL細(xì)胞裂解液的比例進(jìn)行BxPC-3細(xì)胞裂解。按照試劑盒要求，依次配制WST工作液及酶工作液，待測(cè)樣品中依次加入對(duì)照溶液、WST工作液、酶工作液并充分混勻。37 ℃恒溫箱中孵育20 min，在450 nm測(cè)定吸光度。按以下公式先計(jì)算抑制率，再計(jì)算SOD酶活力單位。

隨著高等教育改革的迅速發(fā)展，高校學(xué)生管理不再受限于教育部下發(fā)的學(xué)生管理體制和規(guī)定，而是站在學(xué)生的角度進(jìn)行服務(wù)和管理，從心理、生理、興趣愛好、知識(shí)儲(chǔ)備等多個(gè)方面進(jìn)行思考，由此把握學(xué)生的思想動(dòng)向，進(jìn)行教育管理。當(dāng)代大學(xué)生不僅是受教育者的身份，他與管理者具有平等的地位和權(quán)利。因此，高校管理應(yīng)該運(yùn)用科學(xué)的管理理念和方法，將學(xué)生的日常生活和思想教育相結(jié)合，不斷優(yōu)化學(xué)生的各項(xiàng)管理工作，從學(xué)生的角度入手，保護(hù)學(xué)生的權(quán)利，凸顯學(xué)生管理的實(shí)效性和科學(xué)性。

式中，α=2πr/λ為粒子的尺度參量，n為粒子的復(fù)折射率，Qsca、Qabs和Qext分別為單個(gè)霧滴粒子的散射、吸收和消光效率因子, Qsca、Qabs和Qext可由Mie散射理論計(jì)算得出[20]

1.2.7 Western blotting蛋白印跡分析 應(yīng)用裂解液將BxPC-3細(xì)胞充分裂解并提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，分別取等量蛋白加入上樣緩沖液于沸水中煮5 min，于SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳完畢后將凝膠上的蛋白經(jīng)半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀按(膜面積×0.8)mA恒流轉(zhuǎn)印30～60 min至PVDF膜上，充分封閉后，分別加入SOD1、SOD2及β-actin抗體，4 ℃靜置過夜，洗膜后再加入特定比例稀釋好的二抗溶液室溫孵育2 h，再次洗膜后加入發(fā)光液，于成像分析系統(tǒng)顯像，Quantity One分析軟件檢測(cè)并分析條帶的灰度值。

1.2.8 腫瘤細(xì)胞siRNA干擾 siRNA是一種小RNA分子，其調(diào)控機(jī)制是通過互補(bǔ)配對(duì)引起相應(yīng)靶位基因的表達(dá)發(fā)生沉默。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)BxPC-3轉(zhuǎn)染了SOD2的小RNA干擾片段，從而沉默該基因。si-SOD2干擾序列見表1。

秸稈禁燒是一個(gè)綜合性的系統(tǒng)工程，難以在短期內(nèi)一蹴而就。當(dāng)前，由于農(nóng)民環(huán)保意識(shí)不強(qiáng)、秸稈回收成本較高、政府財(cái)政資金支持不足以及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展滯后等原因，秸稈禁燒推進(jìn)難度比較大。因此，必須堅(jiān)持疏堵結(jié)合、以疏為主的原則，促進(jìn)該項(xiàng)工程的實(shí)施。

表1 si-SOD2干擾序列Tab.1 The interference sequences of si-SOD2

BxPC-3種植于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約50%時(shí)，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染si-SOD2進(jìn)入細(xì)胞。用稀釋好的含有Lipofectamine 2000的無血清DMEM與含有siRNA的無血清DMEM培養(yǎng)基輕柔、充分混合，在室溫下放置20 min，從而形成siRNA-Lipofectamine 2000混合物。將上述混合溶液(500 μL/孔)加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并加入1.5 mL無血清、無抗生素的DMEM培養(yǎng)基，充分混勻后放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。6 h后將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含有血清成分及干預(yù)因素的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取BxPC-3細(xì)胞的總蛋白進(jìn)行Western blotting分析，觀察干擾效果。

其次，對(duì)于目前績(jī)效管理機(jī)構(gòu)也需要進(jìn)行必要完善，促使醫(yī)院績(jī)效管理機(jī)制趨于健全、完善，建立、健全績(jī)效管理制度以及機(jī)構(gòu)，對(duì)于醫(yī)院健康以及穩(wěn)定發(fā)展具有重要作用，應(yīng)當(dāng)建立申訴制度，如果出現(xiàn)不公平情況應(yīng)當(dāng)有效處理，促使考核更加公正、公平。人力資源管理過程當(dāng)中應(yīng)當(dāng)高度重視績(jī)效考核。對(duì)于財(cái)務(wù)部門而言，應(yīng)當(dāng)給予績(jī)效管理部門一定數(shù)據(jù)支持，這樣績(jī)效管理就可以根據(jù)財(cái)務(wù)部門提供的數(shù)據(jù)做出正確以及科學(xué)考核，另外其他部門需要制定出合理年度計(jì)劃，然后交給人力資源管理部門進(jìn)行審核匯總，提升人力資源管理工作質(zhì)量和效率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，三組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

約束混凝土與無約束混凝土材料應(yīng)力-應(yīng)變關(guān)系采用Opensees材料庫中的Kent-Park提出的Concrete01模型[6-7]，該模型是Kent等人通過大量矩形箍筋墩柱的試驗(yàn)提出的，并在實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用。

2 結(jié) 果

H2O2是ROS的重要成分之一。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步測(cè)定了高濃度葡萄糖對(duì)BxPC-3中H2O2產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加(5.5～25 mmol/L)，BxPC-3細(xì)胞產(chǎn)生H2O2的量明顯升高(圖2)，提示高糖誘導(dǎo)的H2O2存在濃度依賴性，且該變化不受滲透壓的影響(5.5 mmol/L葡萄糖組與甘露醇對(duì)照組產(chǎn)生的H2O2相當(dāng))。

圖1 葡萄糖對(duì)BxPC-3細(xì)胞總ROS的影響Fig.1 The effect of glucose onthe production of ROS inBxPC-3 cells

2.1 高糖對(duì)胰腺癌細(xì)胞ROS生成的影響 首先檢測(cè)葡萄糖培養(yǎng)后BxPC-3細(xì)胞產(chǎn)生的ROS。BxPC-3細(xì)胞在不同濃度的葡萄糖(5.5、12.5、25 mmol/L)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，以5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇(滲透壓相同)為對(duì)照，檢測(cè)總ROS水平。結(jié)果顯示，BxPC-3細(xì)胞產(chǎn)生的ROS隨葡萄糖濃度的增加而遞增，12.5和25 mmol/L組的ROS顯著高于正常濃度葡萄糖(5.5 mmol/L)組；而對(duì)照組的ROS與5.5 mmol/L葡萄糖組無顯著性差別，表明ROS的升高并非由滲透壓所導(dǎo)致(圖1)。

圖2 不同濃度葡萄糖干預(yù)對(duì)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞H2O2產(chǎn)生的影響Fig.2 The effect of different glucose concentrations on the production of H2O2in BxPC-3 cells

2.2 高糖對(duì)胰腺癌細(xì)胞抗氧化酶生成的影響 應(yīng)用相應(yīng)試劑盒對(duì)BxPC-3細(xì)胞在不同糖濃度條件下所產(chǎn)生的CAT、GPX及SOD進(jìn)行了定量測(cè)定。結(jié)果顯示，在48 h時(shí)間點(diǎn)，隨著葡萄糖濃度的遞增(5.5～25 mmol/L)，BxPC-3細(xì)胞的總SOD活力逐漸升高，葡萄糖的滲透壓作用對(duì)SOD的變化無明顯影響。此外，高糖狀態(tài)還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞CAT活力的提高，鑒于高糖環(huán)境可以使胰腺癌細(xì)胞 H2O2產(chǎn)生增高，考慮CAT的提升可能是由于高糖誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞生成H2O2后的一種代償性反應(yīng)。高糖環(huán)境對(duì)GPX的產(chǎn)生無明顯影響(表2)。

表2 葡萄糖對(duì)BxPC-3 細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Tab.2 The effect of glucose on the activities of antioxidant enzymes in BxPC-3 cells (u/mg蛋白)

為了進(jìn)一步明確高糖狀態(tài)對(duì)SOD1、SOD2蛋白水平的影響，用Western blotting檢測(cè)不同糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后BxPC-3細(xì)胞抗氧化物酶蛋白水平的變化。結(jié)果顯示，高糖對(duì)SOD1表達(dá)并無明顯影響，而25 mmol/L葡萄糖組的SOD2表達(dá)水平明顯高于正常濃度的葡萄糖組(圖3)。

圖3 高糖對(duì)BxPC-3細(xì)胞SOD1、SOD2蛋白表達(dá)的影響Fig.3 The effect of hyperglycemia on the protein expressions of SOD1and SOD2in BxPC-3 cells

2.3 篩選SOD2的干擾片段 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了3對(duì)SOD2siRNA干擾序列，編號(hào)為782(si-SOD2-1)、593(si-SOD2-2)及429(si-SOD2-3)。分別用3對(duì)SOD2siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染BxPC-3細(xì)胞，選擇合適的干擾序列，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)72 h，進(jìn)而檢測(cè)SOD2的表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，序列429(si-SOD2-3)可顯著降低SOD2的蛋白水平表達(dá)，抑制率約70%，因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇序列429(si-SOD2-3)為SOD2的干擾序列(圖4)。

圖4 si-SOD2對(duì)BxPC-3細(xì)胞SOD2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of si-SOD2on the protein expression of SOD2in BxPC-3

2.4 si-SOD2對(duì)H2O2產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控作用 SOD主要功能是歧化超氧陰離子生成H2O2。本部分實(shí)驗(yàn)通過沉默BxPC-3細(xì)胞中的 SOD2基因，觀察對(duì)H2O2產(chǎn)生所造成的影響。選擇429小RNA干擾序列轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞，隨后常規(guī)培養(yǎng)48 h，加入不同糖濃度培養(yǎng)基繼續(xù)干預(yù)48 h，用試劑盒定量測(cè)定H2O2的產(chǎn)生。結(jié)果顯示，在高糖狀態(tài)下(25 mmol/L)，SOD2基因的沉默可以明顯下調(diào)胰腺癌細(xì)胞H2O2的生成，表明高糖誘導(dǎo)H2O2的生成的是由SOD所調(diào)節(jié)(圖5)。

圖5 SOD2基因沉默對(duì)BxPC-3細(xì)胞H2O2產(chǎn)生的影響Fig.5 The effect of si-SOD2on the production of H2O2in BxPC-3

3 討 論

胰腺癌惡性程度高，早期診斷困難，易發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移，且對(duì)放化療不敏感。此外，胰腺癌確診時(shí)，僅有20%的患者可以接受根治性手術(shù)，5年生存率不到5%[3]。造成胰腺癌預(yù)后極差的原因主要是由于患者缺乏明顯的早期臨床表現(xiàn)，并且目前尚無高敏感性的診斷方法，胰腺癌早期診斷率僅5%～7%?；颊叽_診時(shí)往往已到了不可逆轉(zhuǎn)的晚期，發(fā)生了局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。探究胰腺癌的危險(xiǎn)因素、發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療靶點(diǎn)，是目前的研究熱點(diǎn)。

關(guān)于糖尿病與胰腺癌之間的關(guān)系一直存在著爭(zhēng)論。部分學(xué)者認(rèn)為，糖尿病是胰腺癌的臨床表現(xiàn)，糖尿病的發(fā)生可能與胰腺癌進(jìn)展過程中破壞胰腺組織(胰島細(xì)胞損傷)相關(guān)，腫瘤在發(fā)展的過程中可產(chǎn)生自身抗體和部分多肽，從而引起胰島素抵抗，并加重糖尿病[5]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在對(duì)伴有糖尿病的胰腺癌患者行胰十二指腸切除術(shù)后，超過半數(shù)的新發(fā)糖尿病患者血糖水平可降至正常，提示存在腫瘤誘發(fā)糖尿病的可能性[6]。另一部分學(xué)者則認(rèn)為，糖尿病是胰腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，因?yàn)榇罅康牧餍胁W(xué)資料提示糖尿病狀態(tài)可增加胰腺癌的罹患風(fēng)險(xiǎn)。此外，糖尿病對(duì)已發(fā)生的胰腺癌具有明顯的促進(jìn)作用[7]，用降糖藥后腫瘤可明顯抑制[8]。不可否認(rèn)的是，無論糖尿病與胰腺癌孰因孰果，大約80%的胰腺癌患者確診時(shí)存在糖耐量異常甚或糖尿病。本研究就高糖狀態(tài)對(duì)胰腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的調(diào)控展開討論。

氧化應(yīng)激是機(jī)體ROS與抗氧化物質(zhì)的一種失衡狀態(tài)。當(dāng)ROS水平超過抗氧化物的調(diào)節(jié)能力時(shí)，機(jī)體處于氧應(yīng)激狀態(tài)。ROS對(duì)細(xì)胞的影響存在雙重作用：在正常生理情況下，ROS可以幫助機(jī)體抵御外界各種因素的刺激并可作為第二信使調(diào)控細(xì)胞生理機(jī)能；然而ROS水平過高則會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡、染色體變異、甚至腫瘤形成[9]。近年的研究發(fā)現(xiàn)高糖微環(huán)境可以直接激發(fā)氧應(yīng)激[10]。高糖微環(huán)境誘發(fā)氧應(yīng)激出現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵途徑即激活線粒體氧化呼吸鏈。BROWNLEE等[11]強(qiáng)調(diào)，處于高糖環(huán)境下的細(xì)胞，其無氧糖酵解產(chǎn)物丙酮酸及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸明顯提高，由此可以導(dǎo)致線粒體內(nèi)質(zhì)子梯度的增高及后續(xù)ROS的生成。高糖微環(huán)境可通過多條途徑促進(jìn) ROS產(chǎn)生：在生理?xiàng)l件下，葡萄糖經(jīng)糖酵解及氧化磷酸化代謝可產(chǎn)生ROS；而在高糖環(huán)境中，糖酵解及甘油醛分解代謝受到不同程度影響，由此導(dǎo)致葡萄糖、二磷酸果糖及三磷酸甘油醛通過山梨醇代謝途徑、氨基己糖通路、PKC活化、丙酮醛途徑、甘油自氧化及氧化磷酸化等過程代謝并導(dǎo)致ROS的生成[12]。此外，高糖狀態(tài)在誘導(dǎo)ROS生成的同時(shí)可以引起線粒體形態(tài)學(xué)及動(dòng)力學(xué)改變：線粒體聚變減少，裂變?cè)龆?。而線粒體碎片的出現(xiàn)可進(jìn)一步影響氧化代謝，增加ROS產(chǎn)生，出現(xiàn)惡性循環(huán)[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖狀態(tài)可以促進(jìn)BxPC-3細(xì)胞總ROS及H2O2的產(chǎn)生，而H2O2生成的增多可能與高糖誘導(dǎo)的SOD2分泌加強(qiáng)相關(guān)。盡管同樣作為抗氧化酶系列，SOD與CAT、GPX作用相反，SOD可通過歧化作用加速H2O2的產(chǎn)生，而CAT、GPX可分解H2O2生成水和氧氣。實(shí)驗(yàn)中，我們通過檢測(cè)抗氧化酶的活性及蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)可以提高SOD2的產(chǎn)生進(jìn)而增加H2O2的含量，而CAT的提升可能為細(xì)胞的一種代償性反應(yīng)。

1.2.5 細(xì)胞中CAT活力的檢測(cè) 用細(xì)胞裂解液裂解BxPC-3細(xì)胞，使蛋白終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。按照試劑盒要求測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線后，取裂解液5 μL至1.5 mL EP管中，加入CAT檢測(cè)緩沖液至體積為40 μL，充分混勻后加入250 mmol/L H2O2溶液10 μL，25 ℃反應(yīng)5 min后加入CAT反應(yīng)終止液450 μL。另取EP管，內(nèi)加40 μL CAT檢測(cè)緩沖液，再加入10 μL已終止的上述反應(yīng)體系，混勻后取10 μL加入到96孔板中，并加入200 μL H2O2顯色工作液。25 ℃恒溫箱中孵育20 min后測(cè)定A520。根據(jù)以下公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞樣品中CAT活力：

近年來，大量文獻(xiàn)指出，抗氧化酶對(duì)ROS的清除作用可以抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。SHIMOJO等[14]發(fā)現(xiàn)處于缺氧環(huán)境的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1及MIA PaCa-2所產(chǎn)生的ROS增多，并伴隨著上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的發(fā)生及腫瘤侵襲能力的提高，當(dāng)給予抗氧化酶N-乙酰半胱氨酸干預(yù)后，缺氧狀態(tài)對(duì)腫瘤細(xì)胞的EMT誘導(dǎo)作用被明顯抑制。LEWIS等[15]發(fā)現(xiàn)胰腺癌腹水轉(zhuǎn)移株Capan-1表達(dá)SOD1及SOD2的水平明顯較原發(fā)細(xì)胞株MIA PaCa-2高。而應(yīng)用SOD直接干預(yù)腫瘤細(xì)胞，由于H2O2的產(chǎn)生，腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移能力可以明顯提高[16]。作為重要的H2O2清除劑，CAT不僅可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，而且可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[17]。

1.2.6 細(xì)胞中GPX活性的檢測(cè) 裂解后的BxPC-3細(xì)胞按照試劑盒要求，在96孔板中依次加入GPX檢測(cè)緩沖液、待測(cè)樣品和GPX檢測(cè)工作液，充分混勻后加入過氧化物試劑溶液，震蕩混勻。用酶標(biāo)儀連續(xù)測(cè)定3 min A340；按公式計(jì)算樣品GPX活力：

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度葡萄糖可以明顯升高胰腺癌細(xì)胞ROS及H2O2水平，其中H2O2的產(chǎn)生與SOD2的升高有關(guān)。高糖微環(huán)境是否可通過H2O2的產(chǎn)生影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及相關(guān)信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)以氧應(yīng)激為中心，將胰腺癌與糖尿病相關(guān)聯(lián)，為合并糖尿病的胰腺癌患者治療提供一種新的思路。

[1] NOGUEIRA V, HAY N. Molecular pathways: reactive oxygen species homeostasis in cancer cells and implications for cancer therapy[J]. Clin Cancer Res, 2013, 19(16):4309-4314.

[2] CUI Y, ANDERSEN DK. Diabetes and pancreatic cancer[J]. Endocr Relat Cancer, 2012, 19(5):F9-F26.

[3] SIEGEL RL, MILLER KD, JEMAL A. Cancer statistics, 2016[J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(1):7-30.

[4] XIAO Z, LUO G, LIU C, et al. Molecular mechanism underlying lymphatic metastasis in pancreatic cancer[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014 925845.

[5] SARUC M, IKI K, POUR PM. Morphometric studies in human pancreatic cancer argues against the etiological role of type 2 diabetes in pancreatic cancer[J]. Histol Histopathol, 2010, 25(4):423-432.

[6] PANNALA R, LEIRNESS JB, BAMLET WR, et al. Prevalence and clinical profile of pancreatic cancer-associated diabetes mellitus[J]. Gastroenterology, 2008, 134(4):981-987.

[7] 黎韡，李軍輝，馬清涌. 胰腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)及保護(hù)因素[J]. 國際腫瘤學(xué)雜志，2009, 36(3):221-224.

[8] SORANNA D, SCOTTI L, ZAMBON A, et al. Cancer risk associated with use of metformin and sulfonylurea in type 2 diabetes: a meta-analysis[J]. Oncologist, 2012, 17(6):813-822.

[9] LI W, MA Q, LIU J, et al. Hyperglycemia as a mechanism of pancreatic cancer metastasis[J]. Front Biosci (Landmark Ed), 2012, 17:1761-1774.

[10] SHARMA R, BURAS E, TERASHIMA T, et al. Hyperglycemia induces oxidative stress and impairs axonal transport rates in mice[J]. PLoS One, 2010, 5(10):e13463.

[11] BROWNLEE M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J]. Nature, 2001, 414(6865):813-820.

[12] ROLO AP, PALMEIRA CM. Diabetes and mitochondrial function: role of hyperglycemia and oxidative stress[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2006, 212(2):167-178.

[13] PALMEIRA CM, ROLO AP, BERTHIAUME J, et al. Hyperglycemia decreases mitochondrial function: the regulatory role of mitochondrial biogenesis[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2007, 225(2):214-220.

[14] SHIMOJO Y, AKIMOTO M, HISANAGA T, et al, Attenuation of reactive oxygen species by antioxidants suppresses hypoxia-induced epithelial-mesenchymal transition and metastasis of pancreatic cancer cells[J]. Clin Exp Metastasis, 2013, 30(2):143-154.

[15] LEWIS A, DU J, LIU J, et al. Metastatic progression of pancreatic cancer: changes in antioxidant enzymes and cell growth[J]. Clin Exp Metastasis, 2005, 22(7):523-532.

[16] LI W, CAO L, HAN L, et al. Superoxide dismutase promotes the epithelial-mesenchymal transition of pancreatic cancer cells via activation of the H2O2/ERK/NF-kappaB axis[J]. Int J Oncol, 2015, 46 (6):2613-2620.

[17] GLORIEUX C, DEJEANS N, SID B, et al. Catalase overexpression in mammary cancer cells leads to a less aggressive phenotype and an altered response to chemotherapy[J]. Biochem Pharmacol, 2011, 82(10):1384-1390.

(編輯 卓選鵬)

Journal of Pharmaceutical Analysis 征稿啟事

JournalofPharmaceuticalAnalysis(JPA，《藥物分析學(xué)報(bào)》)創(chuàng)辦于2011年，雙月刊，是一本藥物分析研究領(lǐng)域的英文專業(yè)雜志，由教育部主管、西安交通大學(xué)主辦，與Elsevier 合作出版，在全球范圍內(nèi)公開發(fā)行。CN 61-1484/R，ISSN 2095-1779。采用EES投審稿系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)投稿、審稿、編修和生產(chǎn)的網(wǎng)絡(luò)化，通過ScienceDirect平臺(tái)在線出版，并開放獲取。JPA主要報(bào)道與藥品質(zhì)量、用藥安全和分析方法等相關(guān)的最新研究成果，包括：(1)中藥(藥材、成藥、方劑、注射劑)分析；(2)藥物復(fù)雜體系分析；(3)生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制技術(shù)與方法；(4)藥物體內(nèi)作用過程分析；(5)藥物發(fā)現(xiàn)過程中的定量與定性分析；(6)分子藥理學(xué)中的示蹤分析；(7)生物藥劑學(xué)中的定量分析；(8)臨床檢驗(yàn)與生物分析等。欄目設(shè)有：Review, Original Articles 和 Short Communication。

在酒店運(yùn)行過程中，嚴(yán)格按照費(fèi)用明細(xì)計(jì)劃執(zhí)行，日常所有經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)開支均實(shí)行總經(jīng)理“一支筆”審批制度，防止了財(cái)務(wù)開支多頭審批的弊端，堵塞了財(cái)務(wù)開支上的漏洞，強(qiáng)化了少花錢多辦事的效率、效益觀念，為酒店節(jié)省了大量資金。

自創(chuàng)刊以來，JPA先后被ESCI、Scopus、荷蘭《醫(yī)學(xué)文摘》、美國《化學(xué)文摘(網(wǎng)絡(luò)版)》、美國《國際藥學(xué)文摘》、波蘭《哥白尼索引》、美國《烏利希期刊指南(網(wǎng)絡(luò)版)》、史蒂芬斯數(shù)據(jù)庫和世界衛(wèi)生組織西太平洋地區(qū)醫(yī)學(xué)索引及中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(CSCD)等國內(nèi)外知名數(shù)據(jù)庫收錄。2016年入選由中國科協(xié)、財(cái)政部、教育部、國家新聞出版廣電總局、中國科學(xué)院、中國工程院6部門聯(lián)合組織實(shí)施的中國科技期刊國際影響力提升計(jì)劃二期項(xiàng)目, 獲得C類資助(50萬/年，為期3年)。

歡迎從事相關(guān)研究的學(xué)生、教師和科研工作者將您的原創(chuàng)性研究成果投至JPA，您會(huì)得到熱誠、專業(yè)的服務(wù)。

雜志主頁： http://www.elsevier.com/locate/jpa

投稿網(wǎng)址： http://ees.elsevier.com/JPA

故事到這里似乎該結(jié)束了，但周恩來精神永遠(yuǎn)激勵(lì)著我們。他平易近人、孜孜不倦，為年輕人帶來希望和力量；他不畏艱險(xiǎn)、運(yùn)籌帷幄，為新中國建設(shè)保駕護(hù)航；他勤政為民、鞠躬盡瘁，是中國共產(chǎn)黨人的旗幟和榜樣。

像青青這樣的孩子很多，被父母挑剔、打擊。在孩子還小的時(shí)候，父母是孩子最信賴的人，他們通過父母去認(rèn)識(shí)世界，于是，當(dāng)父母說孩子不可愛時(shí)，孩子會(huì)自動(dòng)加工為：全世界都認(rèn)為我不可愛，我不好。這是多么可怕的邏輯，但又真切地發(fā)生在很多的家庭里。

聯(lián)系方式：

電話：029-82655433 郵箱： JPA2011@126.com 聯(lián)系人：邱老師

電話：029-82655412 郵箱： JPAsubmit@126.com 聯(lián)系人：王老師

通訊地址：西安市雁塔西路76號(hào)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院15號(hào)信箱 郵編：710061

Brown等[26]認(rèn)為ECTR和OCTR是治療腕正中神經(jīng)壓迫的兩種方法，對(duì)145例患者進(jìn)行了169手的前瞻性、隨機(jī)、多中心研究。他們得出結(jié)論無論是開放性還是內(nèi)窺鏡腕管松解術(shù)都取得了較好的效果，但ETCR引起4例并發(fā)癥要高于常規(guī)手術(shù)。他們認(rèn)為此差異是由于ETCR手術(shù)相對(duì)常規(guī)手術(shù)需要更長(zhǎng)的時(shí)間來熟練掌握，需要通過加強(qiáng)培訓(xùn)來減少并發(fā)癥的發(fā)生。

High glucose promotes oxidative stress in pancreatic cancer cells

LI Wei, XU Qin-hong, MA Qing-yong

(Department of Hepatobiliary Surgery, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

Objective To investigate the effects of high glucose on the levels of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant enzymes in pancreatic cancer cell line BxPC-3. Methods After BxPC-3 cells were cultured in different concentrations of glucose, their intracellular ROS level determined using 2,7-dichlorodihydrofluorecein diacetate. The level of intracellular hydrogen peroxide (H2O2) was measured using H2O2assay kit. The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPX) were detected by different antioxidant enzyme analysis kits. The protein levels of SOD1and SOD2were measured by Western blot. The effect of small interfering RNA (siRNA) knockdown of SOD2on the level of H2O2was also tested in pancreatic cancer cells. Results The production of ROS and H2O2was increased by glucose in a concentration-dependent manner (P<0.05). Addition of mannitol, an osmosis regulator, did not affect the levels of ROS and H2O2. Hyperglycemia could increase the activities of T-SOD and CAT as well as the protein expression of SOD2(P<0.05). SOD2siRNA was successfully transfected into BxPC-3 cells, resulting in the inhibition of SOD2protein expression (P<0.05). Down-regulation of SOD2significantly decreased hyperglycemia-induced H2O2level. Conclusion Hyperglycemia can increase ROS level in pancreatic cancer cells. The production of H2O2is related to SOD2level.

high glucose; ROS; H2O2; SOD; pancreatic cancer

2016-03-18

2016-04-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81301846)

Supported by the National Natural Science Foundation of China ( No.81301846)

馬清涌. E-mail: qyma56@mail.xjtu.edu.cn

R735.9

A

10.7652/jdyxb201606004

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1629.006.html(2016-10-10)