西沙必利灌胃對氯吡格雷致大鼠胃黏膜損傷的干預(yù)作用及機制

張靜，陶磊，張子軒，榮峰

（1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，安徽六安237005；2皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院）

西沙必利灌胃對氯吡格雷致大鼠胃黏膜損傷的干預(yù)作用及機制

張靜1，陶磊2，張子軒2，榮峰2

（1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬六安醫(yī)院，安徽六安237005；2皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院）

目的 觀察氯吡格雷對大鼠胃黏膜的損傷作用，并探討西沙必利對黏膜損傷的影響及機制。方法 選取胃潰瘍模型制作后潰瘍完全愈合大鼠48只，隨機分為對照組、氯吡格雷組、西沙必利0.5 mg／kg組、西沙必利0.75 mg／kg組，每組12只。西沙必利兩組分別給予0.5、0.75 mg／kg西沙必利灌胃，1 h后與氯吡格雷組大鼠同時再予8.0 mg／kg氯吡格雷灌胃，之后禁食6 h；對照組給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，連續(xù)灌胃30 d。觀察胃黏膜的病理變化，計算潰瘍復(fù)發(fā)率、胃黏膜損傷指數(shù)評分和上皮細(xì)胞凋亡率；Western blotting法檢測胃黏膜組織Caspase-3、NF-κB、Occludin、ZO-1、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，氯吡格雷組潰瘍復(fù)發(fā)率、胃黏膜損傷指數(shù)評分和上皮細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3、NF-κB、p-p38、p-ERK蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Occludin、ZO-1表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。與氯吡格雷組比較，西沙必利兩組潰瘍復(fù)發(fā)率、胃黏膜損傷指數(shù)評分和上皮細(xì)胞凋亡率降低，Caspase-3、NF-κB、p-p38、p-ERK蛋白表達(dá)水平下調(diào)，Occludin、ZO-1表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。結(jié)論 氯吡格雷可致大鼠胃黏膜損傷，西沙必利可抵抗該損傷，其機制可能與p38、ERK蛋白的磷酸化有關(guān)。

胃潰瘍；西沙必利；氯吡格雷；緊密連接蛋白；細(xì)胞凋亡

氯吡格雷屬于抗血小板藥物，臨床廣泛用于治療缺血性心腦血管疾病，但其引發(fā)的胃腸道損傷不良反應(yīng)發(fā)生率較高［1，2］。目前，臨床常聯(lián)合使用質(zhì)子泵抑制劑預(yù)防氯吡格雷引發(fā)的胃腸道損傷，但質(zhì)子泵抑制劑會增加急性冠狀動脈綜合征患者死亡的危險［3，4］。研究報道，非選擇性5-羥色胺4（5-HT4）受體激動劑西沙必利具有胃黏膜保護作用，但其具體機制還不明確［5，6］。2014年2月～2015年3月，我們對此問題進行了研究。

1　材料與方法

1.1材料 健康雄性清潔級SD大鼠66只，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；Caspase-3、NF-κB抗體購自Abcam公司；ZO-1抗體購自Santa Cruz公司；Occludin、p-p38、p-ERK、p-JNK購自Cell Signal Technology公司；BCA蛋白定量測定試劑盒、ECL發(fā)光液購自ThermoFisher Scientific公司；羊抗鼠、羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；氯吡格雷片為賽諾菲（杭州）制藥有限公司產(chǎn)品；西沙必利片為浙江京新藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；羧甲基纖維素鈉購自山東聊城阿華制藥有限公司。

1.2胃潰瘍模型建立及分組 實驗操作遵循《實驗動物學(xué)》有關(guān)規(guī)定，實驗設(shè)計及實施均經(jīng)過本院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。大鼠術(shù)前均禁食24 h，乙醚麻醉后開腹，將內(nèi)徑為6 mm的塑料管緊貼于胃體與幽門交界處的漿膜面注入乙酸，25 s后移除，縫合手術(shù)切口。胃潰瘍模型制作后的第3、15、25天，同一時間點開始禁食24 h，禁食后處死，每次6只，觀察潰瘍愈合情況及測量潰瘍面積。在第26天證實潰瘍完全愈合的基礎(chǔ)上，將剩余大鼠隨機分為對照組、氯吡格雷組、0.5 mg／kg西沙必利組、0.75 mg／kg西沙必利組，每組12只。用0.5%羧甲基纖維素鈉分別溶解氯吡格雷和西沙必利。對照組給予0.5%羧甲基纖維素鈉（10 mL／kg）灌胃后禁食7 h。氯吡格雷組給予氯吡格雷（8.0 mg／kg）灌胃后禁食7 h。西沙必利預(yù)處理組分別先予0.5、0.75 mg／kg西沙必利灌胃，1 h后再予氯吡格雷（8.0 mg／kg）灌胃，之后禁食6 h。連續(xù)灌胃30 d，每次灌胃前禁食4 h。給藥結(jié)束后處死所有大鼠，觀察潰瘍復(fù)發(fā)情況，并采集標(biāo)本進行后續(xù)各項指標(biāo)的檢測。

1.3胃黏膜損傷評價 ①潰瘍面積測定：沿胃大彎切開胃，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，將潰瘍輪廓描記在透明膠片上，復(fù)制到方格紙上，計算面積。②胃黏膜損傷指數(shù)評分：斑點樣損傷計1分，損傷長度＜1 mm計2分，1～＜2 mm計3分，2～＜4 mm計4分，≥4 mm計5分；若寬度≥2 mm，積分加倍計算。③組織染色觀察：胃組織用4%甲醛固定24 h，脫水，透明，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，400倍光學(xué)顯微鏡下觀察。④胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡檢測：石蠟切片脫蠟，水化，加蛋白酶37℃消化30 min，加0.3%H2O2-甲醇室溫下作用10 min，加0.1%聚乙二醇辛基苯基醚冰上作用2 min，加50 μL反應(yīng)混合液，37℃孵育60 min，加過氧化物酶于37℃作用30 min，加二氨基聯(lián)苯胺室溫顯色10 min，脫水，透明，封固。每例觀察5個視野，以每100個細(xì)胞中棕黃色陽性細(xì)胞所占比例作為凋亡率。

1.4胃黏膜組織中各類蛋白表達(dá)檢測 取各組大鼠胃黏膜組織，加組織裂解液裂解完全，蛋白樣品采用BCA法定量，上樣量為30 μg；經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離后，恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜，之后加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000）、二抗（1∶5 000）進行孵育并洗膜，ECL發(fā)光顯影。采用Western blotting法檢測胃黏膜組織Caspase-3、NF-κB、Occludin、ZO-1、p-p38、p-ERK、p-JNK蛋白表達(dá)，計算其相對表達(dá)量。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組潰瘍愈合情況 乙酸潰瘍模型制作后第4、16、26天，各隨機選取6只大鼠處死觀察，胃潰瘍愈合依次為0、3、6只，潰瘍面積分別為（20.7± 1.5）、（4.5±0.8）、（0.0±0.0）mm2。

2.2各組給藥后潰瘍復(fù)發(fā)、胃黏膜損傷和上皮細(xì)胞凋亡情況 氯吡格雷組與0.75 mg／kg西沙必利組各死亡1只。對照組、氯吡格雷組、西沙必利0.5 mg／kg組、西沙必利0.75 mg／kg組潰瘍復(fù)發(fā)率分別為0、36.4%、16.7%、18.2%。與對照組比較，氯吡格雷組胃潰瘍復(fù)發(fā)率升高（P＜0.05）；與氯吡格雷組比較，西沙必利兩組胃潰瘍復(fù)發(fā)率均降低（P均＜0.05）。各組胃黏膜損傷和上皮細(xì)胞凋亡情況比較見表1。

表1　各組胃黏膜損傷及上皮細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

表1　各組胃黏膜損傷及上皮細(xì)胞凋亡情況比較（±s）

注：與對照組比較，＃P＜0.05；與氯吡格雷組比較，*P＜0.05。

組別n胃黏膜損傷指數(shù)評分（分）上皮細(xì)胞凋亡率（%）對照組120.00±0.002.16±1.02氯吡格雷組1125.35±3.08＃36.35±6.72＃西沙必利0.5 mg／kg組1213.62±2.13*12.83±2.68*西沙必利0.75 mg／kg組1114.03±2.24*13.54±2.19*

2.3各組胃黏膜組織學(xué)變化 對照組大鼠胃腺部黏膜層、黏膜下層、肌層結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，腺體排列緊密，未見炎性細(xì)胞浸潤；氯吡格雷組大鼠潰瘍呈噴口狀，未見深達(dá)黏膜肌層，局部可見壞死組織，毛細(xì)血管廣泛充血擴張，黏膜層和黏膜下層均可見出血，并可見中性粒細(xì)胞浸潤及水腫改變；西沙必利兩組大鼠噴口狀壞死灶明顯減少、變淺，黏膜下層充血水腫減輕。

2.4各組胃黏膜組織各類蛋白表達(dá) 見表2。

表2　各組胃黏膜組織各類蛋白表達(dá)比較（±s）

表2　各組胃黏膜組織各類蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，＃P＜0.05；與氯吡格雷組比較，*P＜0.05。

組別nCaspase-3NF-κBOccludinZO-1p-p38p-ERKp-JNK對照組121.01±0.021.00±0.011.020±0.0211.004±0.0301.01±0.021.00±0.031.00±0.03氯吡格雷組112.05±0.24＃1.66±0.13＃0.326±0.005＃0.185±0.006＃1.94±0.15＃1.69±0.12＃1.12±0.02西沙必利0.5 mg／kg組121.26±0.13*1.42±0.11*0.672±0.014*0.364±0.013*1.22±0.09*1.16±0.07*1.21±0.05西沙必利0.75 mg／kg組111.14±0.15*1.03±0.02*0.581±0.012*0.309±0.017*1.28±0.08*1.08±0.04*1.03±0.03

3　討論

研究表明，既往潰瘍病史患者服用氯吡格雷易發(fā)生再出血，出血部位多為以往潰瘍發(fā)生處，內(nèi)鏡下潰瘍已愈合者單獨服用氯吡格雷6個月后潰瘍的復(fù)發(fā)率達(dá)到11.0%［7］。氯吡格雷作為二磷酸腺苷受體拮抗劑，抑制血小板釋放內(nèi)皮增生和加速修復(fù)潰瘍的血管內(nèi)皮生長因子，可導(dǎo)致潰瘍組織血管生長受抑，從而延遲胃潰瘍的修復(fù)。氯吡格雷也可抑制人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［8］。半夏瀉心湯可通過上調(diào)胃黏膜上皮細(xì)胞中B細(xì)胞淋巴瘤基因-2 mRNA的表達(dá)，下調(diào)活化的凋亡執(zhí)行因子Caspase-3表達(dá)，從而抑制胃黏膜上皮細(xì)胞的過度凋亡發(fā)揮胃黏膜抗應(yīng)激性損傷的作用［9］。本研究結(jié)果顯示，氯吡格雷使胃潰瘍愈合大鼠模型的潰瘍復(fù)發(fā)率上升，胃黏膜損傷指數(shù)及胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡率升高，Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)水平升高。

研究報道，5-HT4受體激動劑西沙比利可增加胃黏膜NO含量，擴張胃黏膜血管，加速損傷炎性因子的排除，抑制血小板聚集，促進HCO3-分泌，發(fā)揮胃黏膜的保護作用［5］。張連陽等［6］觀察西沙必利對大鼠出血性休克復(fù)蘇后胃損害的作用，結(jié)果顯示大鼠胃血流量下降幅度減少，胃黏膜丙二醛含量降低，Na+-K+-三磷酸腺苷酶活性增加，門靜脈血乳酸水平下降，西沙必利可有效改善復(fù)蘇后持續(xù)存在的胃缺血缺氧狀態(tài)。另一種5-HT4受體激動劑莫沙必利可減輕非甾體抗炎藥的促潰瘍作用，對胃黏膜發(fā)揮保護作用［10，11］。本研究結(jié)果顯示，與氯吡格雷組比較，西沙必利干預(yù)后大鼠胃潰瘍復(fù)發(fā)率、胃黏膜損傷指數(shù)評分和上皮細(xì)胞凋亡率明顯減小，Caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)水平下調(diào)，從而發(fā)揮抵抗氯吡格雷所致胃黏膜損傷的作用。

胃腸黏膜上皮屏障功能主要由細(xì)胞內(nèi)緊密連接復(fù)合體維持，其中緊密連接蛋白主要包括跨膜蛋白Occludin、胞質(zhì)附著蛋白ZO-1等［12］。Yang等［13］研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜中ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)明顯降低，腸黏膜通透性增強，導(dǎo)致腸道受損。Wu等［14］研究氯吡格雷對人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1緊密連接蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示隨著氯吡格雷濃度的增加，ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)量呈降低趨勢，此過程p38／絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路處于激活狀態(tài)。MAPK在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、應(yīng)激及炎癥反應(yīng)調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)胃上皮增生、分化、凋亡等過程，且與胃潰瘍形成具有緊密關(guān)系［15］。人類MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由ERK、p38、JNK／MAPK這三個家族組成。高欣等［11］研究表明，莫沙必利對阿司匹林致大鼠急性胃黏膜損傷具有明顯保護作用，其機制可能為降低MAPKs信號通路中ERK和p38蛋白磷酸化程度，并上調(diào)胃黏膜緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)，從而改善胃黏膜屏障的功能。本研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷可下調(diào)胃黏膜組織Occludin、ZO-1的表達(dá)水平，上調(diào)p38、ERK的磷酸化表達(dá)水平；經(jīng)西沙必利干預(yù)后，Occludin、ZO-1的表達(dá)水平升高，p38、ERK的磷酸化表達(dá)水平下降。

綜上所述，西沙必利可通過減少胃上皮細(xì)胞凋亡、抑制潰瘍復(fù)發(fā)和上調(diào)胃黏膜Occludin、ZO-1表達(dá)水平，起到抵抗氯吡格雷所致大鼠胃黏膜損傷的作用，機制可能與p38、ERK的磷酸化有關(guān)。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.011

R-332；R573

A

1002-266X（2016）21-0030-03

張靜（E-mail：wsry558＠126.com）

（2015-09-08）