單純性馬蹄內(nèi)翻足模型鼠足踝部組織中Col9a1基因表達(dá)的研究

王正東，王鑫宇，顏南，孟欣雨，曾亮，王效杰

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2014級(jí)3班；3.醫(yī)學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院康復(fù)教研室）

單純性馬蹄內(nèi)翻足模型鼠足踝部組織中Col9a1基因表達(dá)的研究

王正東1，王鑫宇2，顏南3，孟欣雨2，曾亮1，王效杰1

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)2014級(jí)3班；3.醫(yī)學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院康復(fù)教研室）

目的：研究Col9a1基因在單純性馬蹄內(nèi)翻足（idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV）模型鼠足踝部組織的表達(dá)規(guī)律。方法：制作ICTEV模型，分別取模型組及對(duì)照組大鼠足踝部組織，采用免疫熒光染色及免疫組化染色技術(shù)檢測(cè)Col9a1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：模型組足踝部組織中Col9a1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P＜0.05），主要分布在軟組織和軟骨膜。結(jié)論：Col9a1基因在ICTEV模型大鼠足踝部組織的表達(dá)升高可能與ICTEV畸形的產(chǎn)生有關(guān)。

全反式維甲酸；Col9a1基因；單純性馬蹄內(nèi)翻足；組織；Ⅸ型膠原

單純性馬蹄內(nèi)翻足 （idiopathic congenital talipes equinovarus，ICTEV）是一類比較常見(jiàn)的先天性疾病，其主要表現(xiàn)為嬰兒出生即出現(xiàn)腓側(cè)肌肉痙攣，脛側(cè)肌肉因牽伸而松弛所導(dǎo)致的跟骨內(nèi)翻、足尖內(nèi)收、跖骨旋后、踝關(guān)節(jié)垂下，呈現(xiàn)馬蹄狀。先天和后天均能發(fā)病，發(fā)生率大約為1‰～6‰，男女比例約為3∶1［1］，且男性具有遺傳傾向［2］。其發(fā)病原因目前仍不明確。研究普遍認(rèn)為主要的致病因素為基因遺傳、神經(jīng)、肌肉病變、血管異常、軟組織痙攣等［3］，另外家族遺傳、吸煙、氣候等因素也是引起ICTEV的原因［4-5］。因此研究ICTEV的分子病理機(jī)制及其演變過(guò)程等顯得極為重要。

由于當(dāng)前治療方法等因素限制，獲取ICTEV病理標(biāo)本極為困難。因此，建立ICTEV模型是研究這種疾病致病因素和發(fā)病進(jìn)程的重要基礎(chǔ)。有研究表明：全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）為維生素A衍生物在生物體內(nèi)的正常存在形式，ATRA對(duì)多種動(dòng)物有致畸作用。有報(bào)道稱，孕婦在妊娠初期為治療皮膚病服用維甲酸（RA）可導(dǎo)致胎兒畸形［6］。體內(nèi)發(fā)育中的軟骨細(xì)胞為ATRA的主要靶細(xì)胞，高劑量的ARTA會(huì)影響生長(zhǎng)過(guò)程中骨骼，有致畸作用。已有報(bào)道表明，ATRA可以誘導(dǎo)包括ICTEV在內(nèi)的多種畸形發(fā)生［7］。本研究將使用ATRA誘導(dǎo)孕鼠制作ICTEV模型，作為研究ICTEV機(jī)制的模型。

在目前的研究中與下肢發(fā)育有關(guān)的基因有DTDST、COL9A1［8］、COL1A1［9］、FGF、GIL3［10-11］等。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)84例ICTEV核心家族COL9A1基因簇的7個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行鑒別研究，結(jié)果顯示COL9A1基因可能為ICTEV的易感基因［8］。本研究通過(guò)ATRA灌胃孕鼠，制作ICTEV模型，觀察以這種方法制作的ICTEV模型與ICTEV患者之間是否具有一致性，并且通過(guò)進(jìn)一步檢測(cè)ICTEV模型中Col9a1蛋白的表達(dá)水平及定位，來(lái)判斷其是否與人的Col9a1蛋白表達(dá)具有相關(guān)性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物普通級(jí)SD大鼠140只，雌雄各70只，體重320～350 g，購(gòu)于沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物合格證號(hào)2015-0001）。

1.2ICTEV模型的制作及取材將SD大鼠按雌雄比例1∶1置于籠中夜間交配，第2天通過(guò)陰道涂片檢查，獲得孕鼠63只。將孕10 d的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（22只）和實(shí)驗(yàn)組（41只），實(shí)驗(yàn)組大鼠按135 mg/kg體重用灌胃法給予ATRA（Sigma公司），對(duì)照組給予相應(yīng)體積礦物油。孕21 d剖腹取出胚胎，觀察并選取其足踝部前部?jī)?nèi)收、足后部?jī)?nèi)翻、跖骨旋后、向下垂呈現(xiàn)馬蹄狀的幼鼠，取幼鼠的軟組織制成標(biāo)本。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫熒光方法檢測(cè)Col9a1蛋白的表達(dá)取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組幼鼠足踝部組織標(biāo)本，甲醛固定1 d后，沉入40%蔗糖2 d，常規(guī)制作冰凍切片，采用免疫熒光方法檢測(cè)Col9a1蛋白表達(dá)部位。（1）取0.01 mol/L，pH 7.4的PBS滴于標(biāo)本片上，保持10 min后棄除，置于有蓋瓷搪盒中，使標(biāo)本片處于同一定濕度的環(huán)境；（2）使用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS適當(dāng)稀釋兔抗鼠Col9a1抗體（Santa Cruz Biotechnology公司），使標(biāo)本片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃下保溫30 min；（3）將標(biāo)本片從搪瓷盒中轉(zhuǎn)至標(biāo)本架，首先使用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS沖洗2次，然后依次使其經(jīng)過(guò)0.01 mol/L，pH 7.4的PBS三缸浸泡，每缸5 min，不時(shí)振蕩；（4）取出標(biāo)本片，用濾紙除掉部分水分，但不使標(biāo)本片干燥，滴加一滴一定稀釋度的羊抗兔FITC標(biāo)記的二抗（Santa Cruz Biotechnology公司）；（5）將標(biāo)本片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30 min；（6）重復(fù)操作步驟（3）；（7）取出標(biāo)本片，用濾紙除掉部分水分，滴加一滴緩沖甘油，覆上蓋玻片；（8）使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。

1.3.2免疫組化法檢測(cè)Col9a1蛋白的表達(dá)水平取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組幼鼠足踝部組織標(biāo)本，甲醛固定1 d后，沉入40%蔗糖2 d，常規(guī)制作冰凍切片，免疫組化方法檢測(cè)Col9a1蛋白表達(dá)，用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶染色法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。（1）PBS洗3次；（2）加入過(guò)氧化物酶阻斷液A滅活內(nèi)源性酶，室溫下孵育10 min，PBS洗3次；（3）抗原修復(fù)，檸檬酸鹽緩沖液煮沸8 min，冷卻后取出；PBS洗3次；（4）加非免疫性動(dòng)物血清封閉液B，甩去血清；（5）加入第一抗體4℃過(guò)夜，PBS洗3次；（6）加生物素標(biāo)記的二抗，PBS洗3次；（7）加鏈親和素-過(guò)氧化物酶溶液D，PBS洗3次。（8）加DAB顯色，待顯色后自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹(shù)膠封固。（9）免疫組化染色分析：以不加一抗的正常切片為陰性對(duì)照。Col9a1蛋白為細(xì)胞質(zhì)染色，與陰性對(duì)照進(jìn)行比較。在100倍視野中隨機(jī)取4個(gè)視野，然后采用Imagepro plus 6.0軟件進(jìn)行平均灰度值掃描。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1建模結(jié)果對(duì)照組孕21 d剖腹獲得幼鼠212只，實(shí)驗(yàn)組孕21 d剖腹獲得幼鼠245只，其中74只幼鼠僅具有下肢足部畸形，占30.2%，與人類ICTEV患者足踝部具有一定相似性，均呈現(xiàn)足尖內(nèi)收、踝骨內(nèi)翻、距舟關(guān)節(jié)面由原來(lái)的向前轉(zhuǎn)向內(nèi)側(cè)面，舟骨內(nèi)側(cè)變小且向內(nèi)移位，呈現(xiàn)內(nèi)收畸形，足踝部整體呈現(xiàn)馬蹄狀，表明模型構(gòu)建成功。2.2免疫熒光結(jié)果Col9a1蛋白主要定位于實(shí)驗(yàn)組幼鼠足踝部軟組織及骨化中心部位，在骨細(xì)胞中只有少量表達(dá)，見(jiàn)圖1。

圖1　幼鼠足踝部組織Col9a1蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×100）

2.3免疫組化結(jié)果2組Col9a1蛋白均主要表達(dá)在足踝部軟組織中，在軟骨組織中主要表達(dá)在軟骨膜區(qū)域，在骨組織中有少量表達(dá)，陽(yáng)性顆粒表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)組幼鼠足踝部組織Col9a1蛋白表達(dá)的平均光密度比為（1.8±0.07），明顯高于對(duì)照組（1.0±0.05）（P＜0.05）。

3　討論

1980年，Ippolito等［12］提出了軟組織痙攣導(dǎo)致ICTEV的理論。2004年趙東風(fēng)等［13-14］對(duì)15例ICTEV患者及5例非神經(jīng)、膠原病及肌肉死亡的小兒的踝內(nèi)側(cè)及腓骨肌深筋膜進(jìn)行掃描電鏡對(duì)比研究后，推測(cè)ICTEV的致病因素可能為足內(nèi)側(cè)肌肉纖維化，但是對(duì)具體的分子機(jī)制仍無(wú)法解釋。部分國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)ICTEV患者的足跟部和足踝部韌帶出現(xiàn)異常增厚，認(rèn)為可能是患兒足踝部出現(xiàn)了較多的肥大細(xì)胞和成纖維細(xì)胞［15］，這些細(xì)胞的增生增加了膠原纖維的厚度，可能是導(dǎo)致ICTEV的原因之一。膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，在維持組織器官的完整性，參與人體早期發(fā)育、器官形成、細(xì)胞趨化等方面均起到重要作用。當(dāng)膠原的產(chǎn)生過(guò)多或過(guò)少時(shí)，都可能引起疾病。膠原根據(jù)分子結(jié)構(gòu)分類，可以分為成纖維膠原和非成纖維膠原，其中Ⅸ型膠原可以與成纖維膠原相互作用。Col9a1基因在生長(zhǎng)過(guò)程中編碼Ⅸ型膠原的α1鏈，是構(gòu)成透明軟骨的重要膠原成分；而Ⅸ型膠原在調(diào)節(jié)Ⅱ型膠原直徑方面具有重要作用。Nakata等［16］研究發(fā)現(xiàn)在Col9a1開(kāi)放閱讀框內(nèi)有一段基因缺失可能導(dǎo)致輕微的軟骨發(fā)育不良，隨時(shí)間的推移會(huì)產(chǎn)生骨關(guān)節(jié)炎性病變。國(guó)內(nèi)學(xué)者在25例ICTEV患兒的肌肉組織中檢測(cè)出22例COL9A1（88%）表達(dá)陽(yáng)性，5例正常組織中2例COL9A1（20%）表達(dá)陽(yáng)性，證明了COL9A1基因在人體內(nèi)表達(dá)上調(diào)與ICTEV發(fā)生具有相關(guān)性［8，17］。

圖2　幼鼠足踝部組織Col9a1蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

在當(dāng)前的醫(yī)療環(huán)境下，對(duì)于ICTEV的治療不再使用傳統(tǒng)皮下跟腱切除術(shù)而改用跟腱延伸術(shù)［18-19］，由于極難獲得患者的病例標(biāo)本，因此建立穩(wěn)定的動(dòng)物模型極為重要。大量研究結(jié)果表明，當(dāng)RA處于低濃度時(shí)，可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，在高濃度則會(huì)抑制軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)而引起畸形。一些研究表明，RA的濃度稍稍有所改變將極大地影響成軟骨細(xì)胞的表達(dá)［20］。高濃度RA將過(guò)度激活RA受體，進(jìn)而影響視黃酸信號(hào)系統(tǒng)引導(dǎo)的下游調(diào)控基因的表達(dá)，或干擾其他基因表達(dá)調(diào)控因子來(lái)調(diào)節(jié)靶基因，從而產(chǎn)生畸形［21］。本研究使用ATRA對(duì)實(shí)驗(yàn)組孕鼠灌胃，孕21 d后剖腹取出胎鼠，將出現(xiàn)典型畸形足的實(shí)驗(yàn)鼠與對(duì)照組相對(duì)比，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)鼠足前部向內(nèi)傾斜，距骨變小，位于跟骨后方，呈現(xiàn)菱形；脛骨關(guān)節(jié)內(nèi)屈，跟骨發(fā)生內(nèi)收，產(chǎn)生后足外旋、前足內(nèi)旋［22-23］，內(nèi)側(cè)肌腱、筋膜、韌帶等均存在不同程度的攣縮和變短，距骨骨化中心較正常小，其距骨頭和頸生長(zhǎng)均發(fā)育異常，因此該模型與患兒ICTEV在形態(tài)上具有較高的一致性。但ATRA具有很強(qiáng)的胚胎毒性，造成許多例死胎、吸收胎，而且由ATRA產(chǎn)生的畸形不單單局限于足踝部，還表現(xiàn)在眼部畸形（表現(xiàn)為眼部突出、眼內(nèi)流血、晶狀體渾濁），后足畸形（表現(xiàn)為馬蹄內(nèi)翻足），尾部畸形（表現(xiàn)出無(wú)尾、短尾、螺旋尾），前肢短小，開(kāi)放性脊柱裂等，甚至出現(xiàn)多種畸形共存，這些對(duì)ICTEV模型的制作產(chǎn)生了極大的影響。人類ICTEV患兒的致畸因素多種多樣，包含了遺傳、肌肉、神經(jīng)、環(huán)境、氣候等，是由多種因素作用導(dǎo)致的，且僅僅表現(xiàn)在足踝部，全身其他部位并不表現(xiàn)出畸形，然而ATRA的致畸作用則是作用于全身，會(huì)有多種畸形合并的現(xiàn)象，目前普遍的ICTEV模型制作方法雖存在著與人ICTEV有一定的相似性，但也有很大的局限性。135 mg/kg ATRA灌胃制作ICTEV模型鼠是國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍使用的模型制作方法，且135 mg/ kg ATRA制作的ICTEV模型具有的胚胎毒性和合并畸形率最少，是目前最接近人類ICTEV的模型。

在目前的模型基礎(chǔ)上，本研究采用免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組大鼠Col9a1蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Col9a1蛋白主要表達(dá)在足踝部軟組織中，尤其在骨化中心及軟骨骨膜中。并且2組大鼠經(jīng)免疫組化染色后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組足踝部組織Col9a1蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ATRA灌胃制作的ICTEV模型與ICTEV患兒的COL9A1基因在軟組織表達(dá)上具有一定的相似性。但是由于沒(méi)有記載患兒足踝部軟骨及骨組織COL9A1基因表達(dá)的文獻(xiàn)，并且臨床上也無(wú)法獲得患兒患兒足踝部軟骨及骨組織病理標(biāo)本，所以在該部位的表達(dá)無(wú)法比較。

有研究表明，前列腺素、糖皮質(zhì)激素、血清、各種生長(zhǎng)因子等，在膠原的生理生成和纖維化發(fā)展方面起著重要作用［24-25］。我們推測(cè)ATRA通過(guò)一系列途徑調(diào)節(jié)Col9a1基因表達(dá)上調(diào)，Col9a1基因編碼大量Ⅸ型膠原與成纖維膠原相互作用，產(chǎn)生了大量肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞［15］，隨后膠原發(fā)生聚集沉淀，導(dǎo)致ICTEV初期的局部纖維化，腓側(cè)肌肉痙攣產(chǎn)生較強(qiáng)的拉力，破壞正常的肌力平衡，將患足拉向內(nèi)側(cè)畸形部位，即產(chǎn)生了距骨變下，位于跟骨后方，足前收，外踝后移與跟骨、肌腱等距離變短，距舟關(guān)節(jié)方向發(fā)生改變等表現(xiàn)。

綜上所述，目前由ATRA灌胃產(chǎn)生的ICTEV模型具有一定的局限性。理想的ICTEV模型應(yīng)該是不具有胚胎毒性，并且全身其他部位不發(fā)生畸形。當(dāng)前出現(xiàn)這種理想模型的概率僅有30.2%，建立優(yōu)秀的動(dòng)物模型是進(jìn)行臨床疾病研究的首要工作，對(duì)研究ICTEV有重要的理論價(jià)值和臨床意義，因此在當(dāng)前的模型基礎(chǔ)上進(jìn)行突破創(chuàng)新，探索更加有效的制作方法是極為重要的。同時(shí)，RA調(diào)節(jié)Col9a1基因表達(dá)升高的調(diào)節(jié)途徑以及Col9a1基因以何種方式參與ICTEV的病程發(fā)展目前沒(méi)有明確的發(fā)現(xiàn)。因此，我們需要在動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步尋找Col9a1基因的上游因子，以求揭示ICTEV產(chǎn)生的具體分子機(jī)制。

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（文敏編輯）

Expression ofCol9a1Gene in Ankle Tissue of Rat Model of Idiopathic Congenital Talipes Equinovarus

WANG Zhengdong1，WANG Xinyu2，YAN Nan3，MENG Xinyu2，ZENG Liang1，WANG Xiaojie1
（1.Department of Anatomy，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；2.Grade 14 Class 3；3.Department of Rehabilitation）

Objective：To investigate the expression of Col9a1 gene in ankle tissue of rat model of idiopathic congenital talipes equinovarus（ICTEV）.Methods：ICTEV rat model was established.Immunofluorescence staining and immunohistochemical dyeing technology were used to detect the expression of Col9a1 protein in ankle tissue of model group and control group.Results：The expression level of Col9a1 protein in ankle tissue in model group was higher than that in the control group（P＜0.05），Col9a1 gene expressed primarily in soft tissue and cartilage membrane.Conclusion：The increasing expression level of Col9a1 gene in ankle tissue of ICTEV rats may be related to clubfoot deformity.

all-trans-retinoic acid；Col9a1；idiopathic congenital talipes equinovarus；tissue；collagen typeⅨ

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（No.20133055）

王正東（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：?jiǎn)渭冃择R蹄內(nèi)翻足分子遺傳學(xué).E-mail：wzd_2008@163.com

R682.16

A

1008-2344（2016）06-0426-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.06.003

2016-06-16