瘦素調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期進(jìn)程的研究

周偉強(qiáng)

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

瘦素調(diào)控乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期進(jìn)程的研究

周偉強(qiáng)

（沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧省環(huán)境污染與微生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

目的：研究瘦素誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期進(jìn)程。方法：采用MTT、細(xì)胞活力、凋亡及細(xì)胞周期測(cè)定瘦素刺激乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的生物學(xué)能力。并采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot法測(cè)定瘦素對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期調(diào)控的分子機(jī)制。結(jié)果：瘦素作用濃度為1.25 nmol/L、作用時(shí)間為24 h的條件下對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞有誘導(dǎo)生長(zhǎng)的效果。經(jīng)瘦素處理后的MDA-MB-231細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率和早晚期細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯下降。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)經(jīng)瘦素作用后MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)入S期的細(xì)胞增多。通過篩查瘦素對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子mRNA和蛋白水平表達(dá)影響中發(fā)現(xiàn)，瘦素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期調(diào)控因子相關(guān)的影響主要集中在G1→S期限制點(diǎn)調(diào)控上。結(jié)論：瘦素可顯著刺激乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞惡變性的生物學(xué)能力。

乳腺癌；MDA-MB-231；細(xì)胞周期

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，在我國(guó)，乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的7%～10%，僅次于子宮頸癌，近幾年發(fā)病率攀升，并有年輕化趨勢(shì)，是婦女惡性腫瘤死亡的主要原因之一，嚴(yán)重危害女性身心健康［1］。自上世紀(jì)80年代以來，隨著對(duì)乳腺癌發(fā)生的不斷認(rèn)識(shí)，乳腺癌的預(yù)防、治療有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但有效地預(yù)防和阻斷乳腺癌發(fā)生和發(fā)展仍是乳腺癌研究的關(guān)鍵和難點(diǎn)之一。

瘦素（Leptin）是Zhang等［2］在1994年通過ob基因定位克隆和定性研究發(fā)現(xiàn)并命名的，由146個(gè)氨基酸組成、主要為體內(nèi)白色脂肪細(xì)胞分泌的16 kDa蛋白質(zhì)。人類Leptin基因位于第7號(hào)染色體的長(zhǎng)臂3區(qū)1帶3亞帶（7q31.3），由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，Leptin通過與相應(yīng)受體OB-Rb結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［3］。

Leptin和乳腺癌的發(fā)生有著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，它可作為一種獨(dú)立危險(xiǎn)因素參與乳腺癌的形成過程［4］。研究表明，隨著正常乳腺細(xì)胞Leptin水平的增加，刺激雌激素過度生成。這些雌激素持續(xù)刺激乳腺鄰近脂肪組織的乳腺上皮細(xì)胞，使乳腺細(xì)胞生長(zhǎng)紊亂、過度增殖，并誘發(fā)相關(guān)的血管增生，最終導(dǎo)致乳腺癌的產(chǎn)生［5］。目前臨床上大約1/3乳腺癌患者為雌激素ER-乳腺癌，以惡性程度高、侵襲性強(qiáng)及預(yù)后差為主要特征，對(duì)于此類乳腺癌人們還沒有完全弄清其致癌機(jī)制，本文選取雌激素ER-乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，探討Leptin在MDA-MB-231細(xì)胞增殖過程中的作用，為進(jìn)一步了解雌激素ER-乳腺癌發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；Leibovitz's L-15培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素及鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；人重組Leptin蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Cell Proliferation Assay試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司；其他的化學(xué)試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素的Leibovitz's L-15培養(yǎng)基中。

1.2.2細(xì)胞增殖測(cè)定將1×104/ml乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞接種于96孔板各孔中，細(xì)胞進(jìn)行無血清同步化處理后加入不同濃度的Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.5、12.5 μmol/L）與細(xì)胞分別孵育24、48和72 h，應(yīng)用CellTiter96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒進(jìn)行MTT測(cè)定MDA-MB-231細(xì)胞增殖的情況。

1.2.3細(xì)胞活力測(cè)定將5×105/ml乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞接種于6孔板各孔中，無血清培養(yǎng)液同步化處理后加入不同濃度Leptin（0、0.625、1.25、2.5、6.5、12.5 μmol/L）與細(xì)胞孵育24 h。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)參照試劑盒說明書進(jìn)行。將孵育后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，收集2×105個(gè)細(xì)胞加入450 μl Count&Viability reagent靜置5 min后應(yīng)用自動(dòng)細(xì)胞分析儀Muse Cell Analyzer（Millipore）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)按1.2.3方法將不同濃度Leptin與MDA-MB-231細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，收集1×106個(gè)細(xì)胞與100 μl Muse Annexin V&Dead Cell reagent室溫孵育20 min。應(yīng)用自動(dòng)細(xì)胞分析儀Muse Cell Analyzer檢測(cè)Leptin作用下MDA-MB-231細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。

1.2.5細(xì)胞周期檢測(cè)將1.25 nmol/L Leptin與5× 105/ml的MDA-MB-231細(xì)胞置于6孔板中共同培養(yǎng)24 h后，加入10 μmol/L BrdU 37℃靜置60 min。加入包被Fluorescein熒光素的抗BrdU單克隆抗體按照Cell Proliferation Assay試劑盒說明書操作程序分別通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡分析Leptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖周期的影響。

1.2.6細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子mRNA表達(dá)的檢測(cè)

細(xì)胞RNA抽提按試劑盒說明書進(jìn)行，第一條鏈cDNA合成后應(yīng)用SYBR Green方法以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。25 μl反應(yīng)體系中包含1×SYBR Green Supermix試劑12.5 μl，0.1 μmol/L上、下游引物各0.5 μl，2 μl cDNA（10 ng）和9.5 μl雙蒸水。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增參數(shù)為：50℃2 min，95℃預(yù)變性2 min；95℃變性15 s，60℃延伸1 min，延伸后檢測(cè)熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，mRNA相對(duì)表達(dá)量按照2-△△Ct法計(jì)算。細(xì)胞周期蛋白Cyclin E1引物序列：上游為5'-AGCGGTAAGAAGCAGAGCAG-3'，下游為5'-TTTGATGCCATCCACAGAAA-3'；CDK4引物序列：上游為5'-GAAACTCTGAAGCCGACCAG-3'，下游為5'-AGGCAGAGATTCGCTTGTGT-3'；CDK2引物序列：上游為5'-CATTCCTCTTCCCCTCATCA-3'，下游為5'-CAGGGACTCCAAAAGCTCTG-3'；NF-κB引物序列：上游為5'-TCTGCTTCCAGGTGA CAGTG-3'，下游為5'-ATCTTGAGCTCGGCAGTG TT-3'；Bcl-2引物序列：上游為5'-GGATGCCTTT GTGGAACTGT-3'，下游為5'-AGCCTGCAGCTTT GTTTCAT-3'；VEGF引物序列：上游為5'-AAGG AGGAGGGCAGAATCAT-3'，下游為5'-ATCTGCA TGGTGATGTTGGA-3'；GAPDH引物序列：上游為5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游為5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。

1.2.7細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子蛋白表達(dá)的檢測(cè)將1.25 nmol/L Leptin與1×106/ml的MDA-MB-231細(xì)胞37℃共同孵育24 h。細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化、離心后，將離心后的細(xì)胞團(tuán)塊裂解，應(yīng)用BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定各樣品的蛋白濃度。將20 μg蛋白樣品液上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜后與相關(guān)一抗4℃振蕩過夜。PVDF膜經(jīng)沖洗后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗振蕩孵育1 h。將等體積混合的ECL化學(xué)發(fā)光底物A、B液均勻加在PVDF膜上，顯色5 min?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光呈像。應(yīng)用ImageJ軟件標(biāo)定膜上各顯影帶的灰度值量化Leptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中各周期調(diào)控因子表達(dá)的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Student's t-test分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果以（±s）表示，采用單因素方差分析方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Leptin對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Leptin對(duì)乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞確實(shí)有誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。在各實(shí)驗(yàn)組中，僅0.625 nmol/L的Leptin未表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)增殖的作用，當(dāng)Leptin濃度達(dá)到1.25 nmol/L時(shí)，作用24 h后即表現(xiàn)出明顯的刺激乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的特性，這種刺激作用一直維持到48 h。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)及培養(yǎng)液養(yǎng)分的消耗，孵育時(shí)間持續(xù)72 h后濃度為1.25 nmol/L的Leptin還有誘導(dǎo)作用。見圖1。

圖1　Leptin誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的MTT分析

2.2Leptin對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡的影響細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Leptin作用24 h后，與對(duì)照組相比，雖然Leptin并未表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性刺激乳腺癌細(xì)胞增殖的特性，但隨著Leptin的加入，MDA-MB-231活細(xì)胞比率還是有不同程度的增加，其中1.25 nmol/L Leptin誘導(dǎo)下MDA-MB-231活細(xì)胞比率由63.9%上升至85.6%，刺激乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)效果最明顯；而隨著Leptin作用濃度的增加，MDA-MB-231細(xì)胞活力并未隨之增加，這說明單純?cè)黾覮eptin作用濃度并不能達(dá)到持續(xù)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的目的，見圖2。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，Leptin作用24 h后發(fā)生凋亡的細(xì)胞明顯減少，其中1.25 nmol/L Leptin作用下MDA-MB-231細(xì)胞中已死亡和發(fā)生凋亡的細(xì)胞比率由對(duì)照組的15.75%和5.40%下降至0.95%和1.70%，見圖3。

圖2　Leptin誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的細(xì)胞活力測(cè)定

圖3　Leptin誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的細(xì)胞凋亡測(cè)定

2.3Leptin對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞BrdU熒光點(diǎn)主要集中于細(xì)胞的胞質(zhì)和核周，呈散在發(fā)布；而在1.25 nmol/L Leptin作用下，MDA-MB-231細(xì)胞中的熒光點(diǎn)主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，呈密集團(tuán)塊狀分布，提示此刻細(xì)胞正處于細(xì)胞復(fù)制旺盛期，見圖4A。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1.25 nmol/ L Leptin作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后，MDAMB-231細(xì)胞中S期細(xì)胞比率由對(duì)照組的22.6%增加至36.5%，與之對(duì)應(yīng)的是G0/G1期細(xì)胞由35.0%下降至28.4%，見圖4B。

圖4　Leptin誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期測(cè)定

2.4Leptin對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)分子表達(dá)變化的影響實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，Leptin作用后乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中CDK2、CDK4、Cyclin E1、Bcl-2、NF-κB和VEGF mRNA表達(dá)水平都有不同程度的增加，見圖5；Western blot結(jié)果顯示，CDK2、Cyclin E1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平在Leptin誘導(dǎo)下表達(dá)量增加，而CDK4和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平未發(fā)生變化，見圖6。

圖5　Leptin作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的分子mRNA表達(dá)的測(cè)定

圖6　Leptin作用乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的分子蛋'白表達(dá)的測(cè)定

3　討論

肥胖癥一直被認(rèn)為是乳腺癌發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，Leptin與肥胖癥密切相關(guān)，其表達(dá)水平的高低與乳腺癌相關(guān)［6］。Ozet等［6］采用放射免疫測(cè)定法對(duì)58例乳腺癌患者血清Leptin水平進(jìn)行檢測(cè)，并選取58例健康人作為對(duì)照組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組血清Leptin水平高于對(duì)照組（P＜0.05）；絕經(jīng)前后、早期和晚期乳腺癌患者血清Leptin水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。于華等［7］應(yīng)用放射免疫分析分別檢測(cè)46例乳腺癌、28例乳腺良性病變患者及41例正常對(duì)照組外周血中Leptin水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組外周血中Leptin水平明顯高于乳腺良性病變組及正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Leptin表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，提示Leptin可作為乳腺癌診斷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，可用于指導(dǎo)乳腺癌的分期和預(yù)后評(píng)價(jià)及治療方案的選擇。

前期研究發(fā)現(xiàn)，Leptin可誘導(dǎo)乳腺癌MDAMB-231細(xì)胞的游走，增強(qiáng)其侵襲力［8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Leptin具有明顯的誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的特性。經(jīng)Leptin處理后的MDA-MB-231表現(xiàn)為細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞死亡率和早晚期細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯下降；經(jīng)Leptin作用后MDA-MB-231進(jìn)入S期的細(xì)胞增多。Leptin通過誘導(dǎo)芳香化酶（Aromatase）的活性來調(diào)節(jié)雌激素的生物活性，因此Leptin具有影響雌激素依賴性乳腺癌發(fā)生的生物學(xué)能力［9-11］。但Leptin對(duì)ER-乳腺癌的作用機(jī)制目前還不是十分清楚。我們通過篩查L(zhǎng)eptin對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響發(fā)現(xiàn)，Leptin對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控因子的影響主要集中在G1→S期限制點(diǎn)調(diào)控上，表現(xiàn)為激活CDK2、CDK4和Cyclin E1的表達(dá)，并通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子Bcl-2的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)Leptin作用后，MDA-MB-231細(xì)胞中NF-κB和VEGF的表達(dá)也顯著增加，由于炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖和凋亡等多種通路都是由NF-κB調(diào)控的［12-13］，因此Leptin可能在乳腺癌發(fā)生過程中以自分泌或旁分泌方式促進(jìn)了正常組織的致癌作用和癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，通過激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在乳腺癌的病程發(fā)展和癌細(xì)胞侵襲性方面起著重要的作用。

綜上所述，Leptin作為脂肪細(xì)胞因子之一，在本實(shí)驗(yàn)中被證明可以刺激乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)，增加腫瘤惡變性的生物學(xué)能力。但目前對(duì)Leptin和乳腺癌關(guān)系的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)未成熟，對(duì)Leptin誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生的具體機(jī)制也尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)為更好地解釋乳腺癌發(fā)生和在不遠(yuǎn)的將來開發(fā)抗乳腺癌藥物提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（文敏編輯）

Leptin Regulates the Progression of Cell Cycle for Breast Cancer Cell Line MDA-MB-231

ZHOU Weiqiang
（Shenyang Medical College，Key Laboratory of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province，Shenyang 110034，China）

Objective：To study cell cycle progression induced by leptin in breast cancer cell line MDA-MB-231.Methods：MTT，cell viability test，apoptosis assays and cell cycle analysis were used to detect the effects of leptin on cell growth and proliferation of breast cancer cell line MDA-MB-231.QPCR and Western blot assay were used to assess the molecular mechanisms of leptin on cell cycle regulation of MDA-MB-231 cells.Results：When treated with 1.25 nmol/L leptin for 24 hours，the MDA-MB-231 cells were stimulated to grow obviously.With the leptin treatment，the cell viability was increased markedly and the cell death rate and apoptosis rate was decreased significantly.Cell cycle assay displayed that S phase cells increased after leptin induction.By screening the mRNA and protein levels of cell cycle regulatory factors，the results were demonstrated that leptin could speed up the transition from G1 to S phase in MDA-MB-231 cells.Conclusion：Leptin can significantly stimulate breast cancer MDA-MB-231 cell growth，strengthen the malignant ability of breast cancer cells.

breast cancer；MDA-MB-231；cell cycle

R394.3

A

1008-2344（2016）06-0421-05

10.16753/j.cnki.1008-2344.2016.06.002

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.81172509）

周偉強(qiáng)（1970—），男（漢），教授.研究方向：乳腺癌發(fā)生與調(diào)控.E-mail：zhouwq@hotmail.com

2016-05-09