金黃色葡萄球菌腸毒素A在免疫應(yīng)答中的作用*

王元元，胡藝丹，陳 冬，蘭景斌，吳明波

成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都 610500)

?

·論 著·

金黃色葡萄球菌腸毒素A在免疫應(yīng)答中的作用*

王元元，胡藝丹，陳 冬，蘭景斌，吳明波△

成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都 610500)

目的 獲得重組表達(dá)、純化金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)，并研究其免疫增強(qiáng)作用。方法 利用基因工程法從金黃色葡萄球菌中克隆腸毒素A基因(sea)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a-sea，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Rosetta)進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行純化；純化后的SEA在白細(xì)胞介素2(IL-2)參與下，與半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)進(jìn)行動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其免疫增強(qiáng)效果。結(jié)果 純化后的SEA產(chǎn)量大約為40 mg/L菌液，SDS-PAGE分析在27 kD處有單一的目的條帶；與對(duì)照組相比，SEA在IL-2的參與下與抗原共同免疫，抗體效價(jià)提高2.5倍。結(jié)論 SEA能夠明顯增強(qiáng)抗原的免疫應(yīng)答效果。

腸毒素A；基因工程；純化；免疫應(yīng)答

金黃色葡萄球菌腸毒素A(SEA)是由金黃色葡萄球菌分泌產(chǎn)生的一種特殊蛋白質(zhì)，是引起細(xì)菌性食物中毒及腸胃炎的主要作用因子，按其抗原性的差異，目前可以分為11個(gè)血清型[1-3]。最早對(duì)腸毒素的研究主要集中在其抗體的制備以及檢測(cè)上，但隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)腸毒素具有強(qiáng)大的免疫活化作用，無(wú)需抗原呈遞細(xì)胞的加工，在極低濃度下(<0.1 pg/mL)就可以大量激活免疫細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫應(yīng)答反應(yīng)，因此它又被稱(chēng)作超抗原[4-5]。SEA被認(rèn)為具有很強(qiáng)的促白細(xì)胞增殖、抑制腫瘤的作用，現(xiàn)階段在腫瘤治療中具有很好的應(yīng)用前景[6-8]。有研究[8]證實(shí)，SEA在特定的條件下能夠激活細(xì)胞的免疫系統(tǒng)，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。

鑒于超抗原強(qiáng)大的刺激T、B淋巴細(xì)胞活化的能力，最近有研究[9]認(rèn)為，超抗原在抗體制備過(guò)程中可能會(huì)增強(qiáng)免疫效果，但也有研究[10]發(fā)現(xiàn)，SEA在體外并不能直接激活T、B淋巴細(xì)胞，SEA對(duì)B淋巴細(xì)胞特異性的激活需要白細(xì)胞介素2(IL-2)的參與。為了研究超抗原對(duì)免疫反應(yīng)的增強(qiáng)作用，本研究通過(guò)基因工程法，將超抗原A 在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)純化后，獲得了高純度高產(chǎn)量的重組SEA，并將純化的SEA在白細(xì)胞介素2(IL-2)存在的條件下進(jìn)行免疫試驗(yàn)，以評(píng)估其對(duì)免疫反應(yīng)的增強(qiáng)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌、E.coilDH5α菌株、Rosetta菌株來(lái)自成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒pET32a來(lái)自成都學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存，限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、XhoI購(gòu)買(mǎi)自Fermentas，T4DNA連接酶購(gòu)買(mǎi)自NEB，DNA純化回收試劑盒購(gòu)買(mǎi)自TIANGEN，弗氏完全、不完全免疫佐劑購(gòu)買(mǎi)自Sigma，半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)來(lái)自實(shí)驗(yàn)室純化，CysC ELISA檢測(cè)試劑盒為正能生物贈(zèng)送(成都)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取 以金黃色葡萄球菌為模板，設(shè)計(jì)引物。通過(guò)PCR的方法獲取SEA的目的基因。本研究利用的載體是pET32a，設(shè)計(jì)上游引物序列為GAATTC-ATGAGTAACCGATTGATT TT,下游引物序列為CTCGAG-TTGGCACAAGC CAT(斜體字母表示附加的酶切位點(diǎn)序列)，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，34個(gè)循環(huán)。用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRI、XhoI酶切載體pET32a以及PCR產(chǎn)物，37 ℃雙酶切5 h。將處理后的載體與PCR產(chǎn)物膠回收?；厥蘸螽a(chǎn)物載體與PCR產(chǎn)物按1∶3比例混合，用T4DNA連接酶在室溫下連接10 min后，轉(zhuǎn)化DH5α。涂含有氨芐青霉素的平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單克隆提質(zhì)粒，送公司測(cè)序。

1.2.2 SEA的表達(dá)與純化 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株，涂含有氨芐青霉素的平板，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單克隆接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，220 r/min，離心半徑15 cm的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)至OD600值約為0.6時(shí)，加入終質(zhì)量濃度為0.4 mmol/L的IPTG，相同條件下誘導(dǎo)4 h后，8 000 r/min，離心半徑15 cm，離心15 min，收菌。

將收集的菌體用Buffer A(1×PBS+10 mM咪唑)重懸，在4 ℃條件下，用高壓均質(zhì)機(jī)(15 000 psi)破4次，破碎后，4 ℃條件下，18 000 r/min，離心半徑15 cm，離心30 min。收集上清，將上清用蛋白純化儀(利穗，10D)過(guò)Ni2+親和層析柱，用Buffer B(1×PBS+500 mM咪唑)梯度洗脫。

1.2.3 煙草花葉病毒酶(TEV)酶切去除組氨酸標(biāo)簽 重組質(zhì)粒pET32a帶有N末端組氨酸標(biāo)簽，在組氨酸標(biāo)簽與目的蛋白間帶有TEV的酶切位點(diǎn)序列。因此，將親和層析純化后的SEA透析，用1×PBS緩沖液透析，去除緩沖液中的咪唑，然后與TEV按照200∶1的比例混合，在4 ℃條件下，酶切12 h。經(jīng)酶切后的SEA蛋白中，加入10 mM咪唑，再次過(guò)組氨酸親和層析柱純化，收集穿透，純化后蛋白用1×PBS緩沖液透析，用于下步免疫試驗(yàn)。

1.2.4 超抗原免疫活性的測(cè)定 為了研究SEA在免疫中發(fā)揮的作用，選取了CysC作為免疫抗原，以4～6周齡的BALB/c小鼠作為免疫對(duì)象(每組10只)， 通過(guò)ELISA法檢測(cè)免疫后小鼠血清中CysC抗體的效價(jià)，評(píng)估SEA對(duì)免疫反應(yīng)的增強(qiáng)效應(yīng)。將各組注射蛋白等體積混勻弗氏完全佐劑，制成油包水的乳化液皮下多點(diǎn)注射小鼠，設(shè)置加入IL-2的對(duì)照組。以后每隔1周用同樣劑量蛋白與弗氏不完全佐劑等體積混勻皮下多點(diǎn)注射，加強(qiáng)免疫3次。第3次免疫時(shí)，不加佐劑，腹腔注射，1周后眼球取血，ELISA試劑盒檢測(cè)血清中產(chǎn)生的CysC抗體效價(jià)。另外，設(shè)置只注射弗氏佐劑的陰性對(duì)照組以及未做任何處理的空白對(duì)照組(表1)。

表1 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)分組與蛋白注射量

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 目的基因 PCR 擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物電泳后可見(jiàn)700 bp左右的DNA片段，與預(yù)期一致。構(gòu)建好的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與sea在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的序列一致(圖1)。

圖1 PCR 后電泳結(jié)果

注：1為DNA marker；2為SEA PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 蛋白純化結(jié)果

洗脫峰出現(xiàn)在咪唑濃度為110～220 mM時(shí)，將洗脫峰透析后，用TEV酶切，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳驗(yàn)證，可以獲得純度較高的SEA重組蛋白，蛋白純度基本達(dá)到電泳純，且其分子量在27 kD處，其大小與超抗原分子量相符(有單一的目的條帶)。最終，經(jīng)發(fā)酵及純化后，每升菌液可以獲得約40 mg去除標(biāo)簽的重組SEA蛋白(圖2)。

圖2 12%SDS-PAGE電泳結(jié)果

注：1.蛋白marker；2.均質(zhì)機(jī)破碎后上清；3.穿透；4.親和層析后蛋白(2.46 mg/mL)；5.TEV酶切后蛋白(1.21 mg/mL)

2.3 超抗原的免疫增強(qiáng)活性

與單獨(dú)注射CysC組比較，在超抗原同時(shí)免疫時(shí)，其免疫后抗體的效價(jià)并沒(méi)有明顯變化(P>0.05)；在IL-2的參與下，用CysC與IL-2聯(lián)合注射小鼠，與CysC組相比，其抗體效價(jià)提高近2倍(P<0.05)；用SEA、IL-2以及CysC共同免疫時(shí)，單位血清內(nèi)抗體效價(jià)最高，約是CysC組的2.5倍(P<0.05)(圖3)。

圖3 SEA免疫增強(qiáng)活性的ELISA測(cè)定結(jié)果

注：與CysC組比較，*P<0.05

3 討論

SEA是現(xiàn)階段研究最為廣泛的超抗原，其在腫瘤治療中具有廣泛應(yīng)用。在我國(guó)已有相關(guān)的SEA用于臨床治療的藥物，但是此類(lèi)藥物是直接從金黃色葡萄球菌中提取的，產(chǎn)量低且還具有一定毒性。因此，獲得高產(chǎn)量的低毒性的SEA具有重要意義。利用基因工程法，從金黃葡萄球菌中克隆sea基因，構(gòu)建表達(dá)載體，并利用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、易于純化、產(chǎn)量高、低毒性等優(yōu)點(diǎn)，有利于超抗原的大批量生產(chǎn)與應(yīng)用。

Haffner等[9]曾報(bào)道，SEA在IL-2的參與下，可以特異性地激活B淋巴細(xì)胞，在抗體制備中也具有較好的應(yīng)用前景，但是對(duì)其在動(dòng)物體內(nèi)的免疫研究并沒(méi)有明確報(bào)道。為了研究SEA對(duì)動(dòng)物體內(nèi)免疫的增強(qiáng)作用，在本研究中，將純化后的SEA用于CysC抗體的制備，結(jié)果顯示，SEA本身對(duì)CysC作為抗原的免疫增強(qiáng)作用并不明顯。SEA在激活B細(xì)胞時(shí)，需要IL-2的參與。本研究檢測(cè)了在IL-2參與的條件下， SEA對(duì)免疫效果的增強(qiáng)作用，結(jié)果顯示，IL-2本身也能夠提高抗原的動(dòng)物免疫反應(yīng)，與單獨(dú)注射CysC組相比，能夠提高血清中CysC抗體效價(jià)將近2倍，說(shuō)明IL-2在單獨(dú)存在的情況下也可以增強(qiáng)免疫效應(yīng)；在SEA與IL-2同時(shí)注射的情況下，免疫增強(qiáng)效果最為明顯，與CysC組相比，單位血清中抗體效價(jià)提高約2.5倍。本研究為SEA后續(xù)在抗體制備中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)，但是鑒于前期用于免疫研究的抗原蛋白僅選取了1種，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要對(duì)其他抗原蛋白在SEA作用下的免疫效果進(jìn)行研究。

[1]Abe J, Ito Y, Onimaru M,etal. Characterization and distribution of a new enterotoxin related superantigen produced by Staphylococcus aureus [J]. Microbiol Immunol, 2000, 44(2): 79-88.

[2]Shaikh N, Leonard E, Martin J M. Prevalence of streptococcal pharyngitis and streptococcal carriage in children: a meta-analysis [J]. Pediatrics, 2010, 126(3): e557-e564.

[3]Johnson D R, Kurlan R, Leckman J,etal. The human immune response to streptococcal extracellular antigens: clinical, diagnostic, and potential pathogenetic implications [J]. Clin Infect Dis, 2010, 50(4): 481-490.

[4]White J, Herman A, Pullen A M,etal. The V beta-specific superantigen staphylococcal enterotoxin B: stimulation of mature T cells and clonal deletion in neonatal mice [J]. Cell, 1989, 56 (1): 27-35.

[5]Sundberg E J, Deng L, Mariuzza R A. TCR recognition of peptide/MHC class II complexes and superantigens [J]. Semin Immunol, 2007, 19(4): 262-271.

[6]鮑行豪， 桑賢輩，陳建立，等．超抗原制劑提升白細(xì)胞的應(yīng)用研究[J]．浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003, 15(7):1-3.

[7]吉曉濱， 臧林泉，謝景華，等．超抗原活化淋巴細(xì)胞對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞系的抑制作用[J].廣東醫(yī)學(xué), 2007, 28(12): 1897-1899.

[8]Dauwalder O，Thomas D，F(xiàn)erry T，etal． Comparative inflammatory properties of staphylococcal superantigenic enterotoxins SEA and SEG: implications for septic shock [J]．Leukoc Biol, 2006, 80 (4): 753-758.

[9]Haffner A C，Zepter K，Elmets C A．Major histocompatibility complex class I molecule serves as a ligand for presentation of the superantigen staphylococcal enterotoxin B to T cells[J]．Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(7): 3037-3042.

[10] 廉慧鋒， 馬興元．B細(xì)胞超抗原及其免疫學(xué)特性[J]．免疫學(xué)雜志, 2005, 21(3): 65-69.

The Role of Staphylococcal Enterotoxin A in the Immune Response

Wang Yuanyuan, Hu Yidan, Chen Dong, Lan Jingbin, Wu Mingbo△.

School of Biomedical Sciences, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China

Objective To recombine and purify the Staphylococcal enterotoxin A (SEA) gene and detect the immune activity of the recombinant SEA. Methods The Staphylococcal enterotoxin A (SEA) gene was cloned into the prokaryotic plasmid pET32a-sea by means of the genetic engineering method. The recombinant protein was expressed in E.coli Rosetta strains and purified by nickle affinity chromatography column. Interleukin-2 (IL-2) and Cystatin C (Cys C) were used to detect the immune activity of the purified SEA. Results The SEA was expressed in E.coli Rosetta successfully and purified with a production rate of 40 mg/L. SDS-PAGE analysis showed a molecular weight of approximately 27 kDa for a subunit of the protein. The immune experiments showed that the SEA enhanced the immune activity by nearly 2.5 times. Conclusion SEA can significantly enhance the immune effect of antigen.

Staphylococcal enterotoxin A; Genetic engineering; Purify; Immune response

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161027.1708.062.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.007

大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(No:201513705015)；大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(No:201513705054)

Q512

A

△通信作者：吳明波，E-mail: wumingboscu@163.com