亞硝酸根的2，3-二氨基吩嗪熒光猝滅法測(cè)定

翟馬躍，梁淑彩，潘宇，劉羽萍，譚支林，劉凡，鄢國(guó)平*

1.武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北　武漢　430074；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北　武漢　430074

亞硝酸根的2，3-二氨基吩嗪熒光猝滅法測(cè)定

翟馬躍1，梁淑彩2*，潘宇1，劉羽萍1，譚支林1，劉凡1，鄢國(guó)平1*

1.武漢工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430074；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北武漢430074

2，3-二氨基吩嗪（DAP）在中性環(huán)境中具有強(qiáng)熒光.發(fā)現(xiàn)其在酸性介質(zhì)中能與亞硝酸根離子反應(yīng)，生成產(chǎn)物在中性環(huán)境下熒光很弱，據(jù)此建立了一種以DAP為探針，熒光猝滅測(cè)定水樣中亞硝酸根離子的方法.在最佳測(cè)定條件下（0.03 mol/L的硫酸，2.0×10-3mol/L十六烷基三甲基溴化銨，反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時(shí)間50 min，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為435 nm和557 nm），體系熒光強(qiáng)度變化與亞硝酸根濃度在0.1 mol/L～2.1×10-6mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測(cè)限為9.8×10-8mol/L.該方法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、長(zhǎng)波長(zhǎng)下檢測(cè)及斯托克位移大的優(yōu)點(diǎn).

熒光分析法；亞硝酸鹽；2，3-二氨基吩嗪；膠束增敏

1　引言

亞硝酸鹽廣泛存在于土壤、水以及食品等物質(zhì)中［1］，應(yīng)用于工、農(nóng)業(yè)以及食品添加劑等方面.其大量應(yīng)用導(dǎo)致環(huán)境污染如水體富營(yíng)養(yǎng)化、地下水污染等，而攝入過量的亞硝酸鹽更是能使人體中毒，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡［2］.因此，亞硝酸根離子的檢測(cè)具有十分重要的意義.熒光分析法操作方便、靈敏度高、反應(yīng)速度快、對(duì)環(huán)境污染小［3］，是測(cè)量亞硝酸根離子的重要分析方法.

熒光法測(cè)定亞硝酸鹽大多是基于探針上的胺基與亞硝酸根離子在酸性條件下的重氮化或者亞硝化反應(yīng)從而使得探針的熒光增強(qiáng)或猝滅.如紫脲酸銨［4］、吲哚［5］、中性紅［6-7］、藏紅T［8］、品紅［9］、熒光素［10-11］、酪氨酸［12］、葉酸［13］等熒光探針都是基于此機(jī)理來測(cè)定亞硝酸鹽的.含鄰二胺基團(tuán)的熒光探針可與亞硝酸鹽反應(yīng)生成三氮唑化合物，如乙二胺［14］、2，3-二氨基萘［15］等，這類熒光探針一般具有更低的檢測(cè)限與更寬的線性范圍.此外有些物質(zhì)如十六烷基三甲基溴化銨、十二烷基苯磺酸鈉等的加入，可使體系熒光大大增強(qiáng)，從而降低了體系的檢測(cè)限，起到膠束增敏的作用.

本文采用含鄰二胺基團(tuán)的2，3-二氨基吩嗪（DAP）作為熒光探針（其結(jié)構(gòu)如圖1所示），以十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）作為增敏劑，建立了膠束增敏熒光猝滅測(cè)定亞硝酸鹽的新方法，并將其用于湖水、雨水和自來水的實(shí)際檢測(cè).

圖1　DAP的結(jié)構(gòu)式Fig.1Structure of DAP

2　實(shí)驗(yàn)部分

2.1試劑及儀器

AR1104電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；F-4600熒光分光光度儀（日立高新技術(shù)公司）.

DAP根據(jù)文獻(xiàn)［16］合成.DAP溶液：用DMSO溶解配制成濃度為1.0×10-2mol/L的儲(chǔ)備液，置于冰箱保存，臨用時(shí)用水稀釋；亞硝酸鈉溶液：用水溶解配置成0.1 mol/L的儲(chǔ)備液，冰箱保存，需每天新配；硫酸、鹽酸、磷酸、氫氧化鈉均配成1.0 mol/L溶液.所有試劑均為分析純，東湖水等實(shí)際樣品需過濾使用，實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

2.2方法

2.2.1DAP與亞硝酸根離子反應(yīng)熒光變化在10 mL比色管中依次加0.3 mL硫酸溶液，0.2 mL CTAB溶液，0.2 mL DAP（儲(chǔ)備液稀釋后成1.0×10-4mol/L），適量亞硝酸根溶液，加水定容至5 mL，50℃下反應(yīng)50 min，加入0.6 mL氫氧化鈉，再次定容至10 mL，同時(shí)作空白試驗(yàn).選擇狹縫寬度為10 nm×20 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為435 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為557 nm，測(cè)定溶液熒光強(qiáng)度.

2.2.2硫酸濃度影響比色管中分別加不同量的硫酸溶液，0.2 mL CTAB溶液，0.2 mL DAP，1.5 mL亞硝酸根溶液（1.0×10-5mol/L），定容至5 mL，50℃下反應(yīng)50 min，加氫氧化鈉至pH為中性，定容至10 mL，同時(shí)作空白試驗(yàn).在狹縫寬度為10 nm× 15 nm（后面實(shí)驗(yàn)均在此狹縫下測(cè)定），激發(fā)波長(zhǎng)λex=435 nm、發(fā)射波長(zhǎng)λem=557 nm的條件下測(cè)定其熒光強(qiáng)度變化△F（△F=F空白-F）.

2.2.3CTAB濃度影響比色管中分別加0.3 mL硫酸溶液，不同量CTAB溶液，0.2 mL DAP，1.5 mL亞硝酸根溶液，定容至5 mL，50℃下反應(yīng)50 min，加入0.6 mL氫氧化鈉，定容至10 mL，同時(shí)作空白試驗(yàn).測(cè)定加入不同量CTAB的熒光強(qiáng)度變化△F.

2.2.4時(shí)間依賴性及溫度影響比色管中分別加入0.3 mL硫酸溶液，0.2 mL CTAB溶液，0.2 mL DAP，1.5 mL亞硝酸根溶液，定容至5 mL，不同溫度下反應(yīng)，加入0.6 mL氫氧化鈉，定容至10 mL，同時(shí)作空白試驗(yàn).測(cè)定不同溫度（25℃、37℃、50℃）反應(yīng)不同時(shí)間的△F.

2.2.5工作曲線、檢測(cè)限與精密度在所選擇的最佳條件下（DAP濃度為2×10-6mol/L、硫酸濃度為0.03 mol/L、CTAB濃度為2.0×10-3mol/L、溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間50 min），配置一系列不同濃度的亞硝酸根溶液，測(cè)定線性范圍，并根據(jù)公式LOD=kS0/S（S0為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差，S是工作曲線斜率，k=3）計(jì)算檢測(cè)限.在最佳條件下加入1.0 mL亞硝酸根溶液，重復(fù)6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.

2.2.6離子干擾在最佳實(shí)驗(yàn)條件下（CDAP=2× 10-6mol/L，CH2SO4=0.03 mol/L，CCTAB=2.0×10-3mol/L），亞硝酸根離子濃度為1.5×10-6mol/L時(shí)，考察其它離子（Cu+、Pb2+、Ni2+、Li+、Al3+、Mn2+、Cd2+、Hg2+、Ag+、Ba2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Cl-、I-、NO3-、Ac-）能夠共存的最大濃度.

2.2.7實(shí)際樣品測(cè)試在最佳實(shí)驗(yàn)條件下加入實(shí)際樣品（自來水加入量為3 mL，雨水2 mL，東湖水為1 mL），加標(biāo)組再加入8.0×10-7mol/L的亞硝酸根溶液，測(cè)定各組熒光強(qiáng)度變化，平均測(cè)定3次，并計(jì)算樣品中亞硝酸根離子含量和加標(biāo)回收率.

3　結(jié)果與討論

3.1熒光光譜

DAP在溶液pH小于6時(shí)基本無熒光，此后隨著pH增加，熒光逐漸增強(qiáng)，最大激發(fā)波長(zhǎng)為435 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為557 nm.在pH為7～8時(shí)熒光強(qiáng)度基本穩(wěn)定；在pH大于8時(shí)熒光強(qiáng)度隨pH值增大而減小.在酸性條件下，DAP能與亞硝酸根離子反應(yīng)，產(chǎn)物在酸性條件下熒光較弱，加堿中和后熒光強(qiáng)度也無明顯增強(qiáng).因此，可以在酸性條件下使亞硝酸根離子和DAP反應(yīng)，在中性條件下進(jìn)行亞硝酸根離子測(cè)定.加入CTAB后體系熒光強(qiáng)度變化增強(qiáng)了十幾倍，表明CTAB對(duì)測(cè)定有增敏作用.另外，加入CTAB后激發(fā)波長(zhǎng)會(huì)小幅度發(fā)生紅移，波長(zhǎng)由425 nm移至435 nm處，發(fā)射波長(zhǎng)基本不變.

圖2是CTAB存在下DAP與亞硝酸根離子反應(yīng)前后熒光光譜圖，其中1和1’是DAP的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，2和2’是與亞硝酸根離子反應(yīng)后的激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng).由圖2可知，在激發(fā)波長(zhǎng)為435 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為557 nm時(shí)，DAP熒光強(qiáng)度很大，加入亞硝酸根離子后熒光明顯發(fā)生猝滅.說明DAP能對(duì)亞硝酸根離子做出響應(yīng).

圖2　DAP與亞硝酸根離子反應(yīng)前后熒光光譜圖Fig.2Fluorescence spectra of DAP before and after reacting with nitrite

3.2酸性介質(zhì)及其濃度影響

在相同實(shí)驗(yàn)條件下分別考察鹽酸、硫酸、磷酸3種介質(zhì)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在硫酸介質(zhì)中體系熒光強(qiáng)度變化△F最大，故選用硫酸作為酸性介質(zhì).不同濃度硫酸溶液對(duì)△F影響結(jié)果如圖3所示，當(dāng)硫酸濃度較小時(shí)，△F隨酸度增大快速而增強(qiáng)，當(dāng)硫酸濃度為0.03 mol/L時(shí)△F達(dá)到最大，之后△F基本不變，所以最終選擇硫酸的最佳濃度0.03 mol/L.

圖3　硫酸濃度對(duì)△F影響Fig.3Effect of sulfuric acid concentration on△F

3.3CTAB濃度影響

不同濃度CTAB溶液對(duì)△F影響如圖4所示. CTAB濃度較小時(shí)，△F隨其增大而快速增強(qiáng)，當(dāng)CTAB濃度為2.0 mmol/L時(shí)達(dá)到最大，之后△F基本不變，所以最終選擇2.0×10-3mol/L作為CTAB的最佳濃度.

圖4　CTAB濃度對(duì)△F影響Fig.4Effect of CTAB concentration on△F

3.4時(shí)間依賴性及溫度影響

如圖5所示，DAP與亞硝酸根離子在25℃下反應(yīng)較慢，120 min后反應(yīng)仍不完全，而在37℃和50℃下，在反應(yīng)時(shí)間小于15 min時(shí)△F迅速增大，在15 min至50 min時(shí)△F增加趨勢(shì)變緩，在50 min時(shí)反應(yīng)基本完全，且在50℃下的△F比在37℃下的△F稍高，故選擇最佳反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)時(shí)間為50 min.

3.5工作曲線、檢測(cè)限與精密度

如圖6所示，亞硝酸根濃度在0.1 mol/L～2.1×10-6mol/L范圍內(nèi)與△F呈良好的線性關(guān)系.其線性回歸方程為：△F=249.2C+26.07（R2=0.999），其中C為亞硝酸根濃度，并根據(jù)公式LOD=kS0/S（空白標(biāo)準(zhǔn)偏差S0=8.2，工作曲線斜率S=249.2，k=3）計(jì)算出檢測(cè)限為9.8×10-8mol/L.加入亞硝酸根離子的濃度為1.0 μmol/L時(shí)，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定6次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%.

圖5　溫度和時(shí)間對(duì)△F影響Fig.5Effect of temperature and time on△F

圖6　工作曲線Fig.6Calibration curve

3.6其它離子干擾

在亞硝酸根濃度為1.5×10-6mol/L時(shí)，相對(duì)誤差在±5%以內(nèi)，允許1 000倍的Cu2+、Pb2+、Al3+、Mn2+、Cl-、NO3-、Ac-，500倍濃度的Ni2+、Li+、Cd2+、Hg2+，100倍的Co2+，50倍的Mg2+、Zn2+，5倍的I-，2倍濃度的Ag+，1倍濃度的Ba2+與亞硝酸根離子共存.

3.7實(shí)際樣品測(cè)定

表1是實(shí)際樣品的亞硝酸根離子含量測(cè)定值與加標(biāo)回收率（三種試樣的加入量分別為3 mL、 1 mL和2 mL）.經(jīng)計(jì)算可得，自來水、東湖水、雨水中亞硝酸根離子含量分別為1.10×10-6mol/L、3.43× 10-6mol/L、2.14×10-6mol/L.

表1　實(shí)際樣品測(cè)定及加標(biāo)回收率Tab.1Determination and recovery rates of nitrite in samples

4　結(jié)語

本文建立了基于2，3-二氨基吩嗪的熒光分析測(cè)定亞硝酸根離子的方法.在最佳實(shí)驗(yàn)條件下的線性范圍為0.1 mol/L～2.1×10-6mol/L，檢測(cè)限為9.8×10-8mol/L.該方法測(cè)定靈敏度高、斯托克位移大，有望用于實(shí)際樣品中亞硝酸根離子的測(cè)定.

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本文編輯：張瑞

Determination of Nitrite with 2，3-Diamino-Phenazine by Fluorescence Quenching Method

ZHAI Mayue1，LIANG Shucai2*，PAN Yu1，LIU Yuping1，TAN Zhilin1，LIU Fan1，YAN Guoping1*
1.School of Materials Science and Engineering，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430074，China

The 2，3-Diamino-phenazine（DAP）has strong fluorescence in the neutral medium.We found that it could react with nitrite in acidic medium，and the produce displayed weak fluorescence in the neutral medium，thus a fluorimetric quenching method for the detection of nitrite in water samples was developed employing DAP as fluorescence probe.Upon the optimum experimental conditions（0.03 mol/L of H2SO4，2.0×10-3mol/L of hexadecyl trimethyl ammonium bromide，reaction temperature of 50℃，reaction time of 50 min，fluorescence detected at 557nm with the excitation wavelength of 435 nm），the fluorescence change was linear to nitrite concentration over the range of 0.1 mol/L-2.1×10-6mol/L with the detection limit of 9.8×10-8mol/L.The proposed method possessed the characteristics of simpleness，sensitivity，long detection wavelength and large Stocks shift.

fluorescence analysis；nitrite；2，3-diamino-phenazine；micellar sensitization

O657.3

A

10.3969/j.issn.1674?2869.2016.05.004

1674-2869（2016）05-0431-06

2016-05-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（51373128，51173140）；武漢市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2013010501010131）；武漢工程大學(xué)研究生教育創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CX2015007，CX2014058）；武漢工程大學(xué)第十期大學(xué)生校長(zhǎng)基金項(xiàng)目（2015004）

翟馬躍，碩士研究生.E-mail：zmyysyy@163.com

鄢國(guó)平，博士，教授.E-mail：guopyan2006@163.com梁淑彩，博士，副教授.E-mail：chirolab@gmail.com