氯化苯丙胺鹽法全自動化檢測微量總蛋白存在重大的方法學(xué)缺陷

莊小青，羅士來，楊 露，夏前鳳，薛 夢

(1.泗陽仁慈醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷 223700；2.泗陽縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷 223700)

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·經(jīng)驗(yàn)交流·

氯化苯丙胺鹽法全自動化檢測微量總蛋白存在重大的方法學(xué)缺陷

莊小青1，羅士來2，楊 露1，夏前鳳2，薛 夢2

(1.泗陽仁慈醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷 223700；2.泗陽縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇宿遷 223700)

目的 探討氯化苯丙胺鹽法全自動化檢測腦脊液或尿液中微量總蛋白發(fā)生嚴(yán)重差錯的原因。方法 將定值總蛋白采用連續(xù)遞減稀釋法獲得35例標(biāo)本(總蛋白質(zhì)量濃度0～30 g/L)，然后在貝克曼DXC800生化分析儀上采用氯化苯丙胺鹽法檢測。結(jié)果 (1)當(dāng)總蛋白質(zhì)量濃度為0～3 g/L時檢測值呈線性增加，與理論值一致。(2)當(dāng)總蛋白質(zhì)量濃度為3～9 g/L時檢測值遞減，在0.5～2.5 g/L之間。當(dāng)總蛋白質(zhì)量濃度大于9 g/L時檢測值趨于0.5 g/L左右。結(jié)論 該法不能滿足全自動化檢測的單區(qū)間要求，即檢測值存在二元性，故不宜單獨(dú)采用全自動生化分析儀檢測。

生物化學(xué)/儀器和設(shè)備; 自動化； 血蛋白質(zhì)類； 氯化苯丙胺鹽

氯化苯丙胺鹽與腦脊液或尿液中微量總蛋白結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的濁度，通過濁度變化確定微量蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。據(jù)文獻(xiàn)報道，該方法穩(wěn)定性好、靈敏度高、線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)[1]。2014年7月至2015年5月作者使用該法試劑盒在全自動生化分析儀上檢測微量總蛋白共計(jì)120例，其中結(jié)果出現(xiàn)嚴(yán)重偏差5例，與臨床診斷不符。經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究表明，該法存在重大方法學(xué)缺陷，即對高質(zhì)量濃度標(biāo)本無反應(yīng)飽和點(diǎn)，無法進(jìn)行糾正與監(jiān)測，導(dǎo)致檢測值存在二元性，易誤診病理性高值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 美國貝克曼定值血清(總蛋白質(zhì)量濃度30 g/L)。

1.2 儀器與試劑 美國貝克曼全自動生化分析儀 Dxc 800及其配套試劑、校準(zhǔn)品；氯化苯丙胺鹽法腦脊液及尿蛋白檢測試劑盒(檢測線性0～3 g/L)，配套標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品(國產(chǎn))。

1.3 方法 確認(rèn)按照試劑盒說明書設(shè)置檢測參數(shù)并定標(biāo)，連續(xù)檢測質(zhì)控品20個工作日，確認(rèn)試劑穩(wěn)定、測量狀態(tài)在控；確認(rèn)檢測人員已熟練掌握儀器與試劑盒使用方法。采用生理鹽水將貝克曼定值血清按約1 g/L質(zhì)量濃度遞減連續(xù)稀釋獲得30份標(biāo)本，再將第30號標(biāo)本(總蛋白質(zhì)量濃度為0.9 g/L)按倍比稀釋法獲取5份標(biāo)本，見表1。將35份標(biāo)本編號后按1～35號和35～1號次序測量2次，取均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Excel2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、計(jì)算、繪圖與制表等。

2 結(jié) 果

總蛋白質(zhì)量濃度大于3 g/L時檢測值不是趨于飽和而是下降，造成檢測值二元性，不能滿足全自動化檢測的單區(qū)間要求。35份標(biāo)本檢測結(jié)果見表2。

表1 定值血清稀釋后質(zhì)量濃度(g/L)

表2 35份標(biāo)本檢測結(jié)果

3 討 論

在微量總蛋白檢測方法中磺基水楊酸比色法需要自配試劑、操作繁瑣、易產(chǎn)生凝塊造成誤差且標(biāo)準(zhǔn)液不統(tǒng)一、精密度較低。染料結(jié)合法和鄰苯三酚紅鉬絡(luò)合法對清蛋白的靈敏度高于球蛋白，且染料易污染比色杯。干化學(xué)法測定線性寬、速度快，但成本很高。據(jù)文獻(xiàn)報道氯化苯丙胺鹽法是較理想的方法[2-8]。

作者在使用該法時發(fā)現(xiàn)會出現(xiàn)嚴(yán)重誤差并據(jù)此進(jìn)行深入探討。對35份標(biāo)本的檢測結(jié)果與理論值繪制成散點(diǎn)圖，見圖1。當(dāng)總蛋白質(zhì)量濃度為0.029～3 g/L時檢測結(jié)果與理論值相關(guān)性好，其散點(diǎn)圖呈直線型(Ⅰ區(qū))；3～6.9 g/L時圖形呈快速下降趨勢(Ⅱ區(qū))；8.1～30 g/L時其散點(diǎn)圖呈低吸光度平緩趨勢(Ⅲ區(qū))。很直觀地表明采用該法檢測高質(zhì)量濃度標(biāo)本時其檢測值不成飽和狀態(tài)，反而快速、無規(guī)律下降(是形成大小不一的凝塊所致)，造成所有結(jié)果均存在二元性。即使采用定性方法確定送檢標(biāo)本為病理性，需進(jìn)行稀釋測定，但也絕對不知如何稀釋才能確保稀釋標(biāo)本待測質(zhì)量濃度在該法檢測線性范圍內(nèi)，否則檢測結(jié)果仍為二元性，說明該法存在重大方法學(xué)缺陷。

圖1 35份標(biāo)本檢測值與理論值配對散點(diǎn)圖

通過對35份標(biāo)本檢測過程進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，根據(jù)圖1的3個不同區(qū)域選擇代表性標(biāo)本繪制檢測反應(yīng)曲線圖，見圖2。曲線1、2、3總蛋白質(zhì)量濃度在該法檢測范圍內(nèi)并逐漸增加，由圖2可見，隨著總蛋白質(zhì)量濃度增加，測量吸光度亦逐漸增加，對每一個標(biāo)本而言，在整個反應(yīng)過程中吸光度是穩(wěn)定逐漸增加的。曲線4、5、6總蛋白質(zhì)量濃度大于該法檢測范圍并逐漸增加，但其最大吸光度、測量吸光度、反應(yīng)速度及反應(yīng)過程均無固定規(guī)律并與曲線1、2、3重疊交叉，說明該法方法學(xué)缺陷是無法在全自動生化分析儀上設(shè)置參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測與糾正[9-11]。

圖2 典型檢測反應(yīng)曲線圖

綜上所述，采用全自動生化分析儀應(yīng)用氯化苯丙胺鹽法檢測微量總蛋白會因方法學(xué)存在缺陷造成所有測量結(jié)果均在其檢測線性范圍之內(nèi)，需人工對檢測值甄別避免高值誤診，故不宜單獨(dú)采用全自動生化分析儀檢測。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.02.063

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1673-4130(2016)02-0275-03

2015-07-09)