咳喘寧對RSV誘發(fā)哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的調(diào)節(jié)作用及對支氣管平滑肌增殖活性的影響

譚維，李英*，羅銀河，王孟清，舒蘭，唐力瓊，龔細(xì)妹，李平，陶洪，彭昕欣

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

·方藥研究·

咳喘寧對RSV誘發(fā)哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的調(diào)節(jié)作用及對支氣管平滑肌增殖活性的影響

譚維1，李英2*，羅銀河2，王孟清2，舒蘭2，唐力瓊1，龔細(xì)妹1，李平1，陶洪2，彭昕欣2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007）

目的觀察咳喘寧對RSV誘發(fā)哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的調(diào)節(jié)作用及對氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)增殖水平（OD值）的影響。方法將60只大鼠隨機分為6組，除正常組外，其余大鼠通過致敏、誘喘、病毒激發(fā)哮喘進行造模。造模完成當(dāng)天分組干預(yù),并用ELISA進行IL-4、IFN-γ水平的測定。造模成功后取支氣管平滑肌進行細(xì)胞培養(yǎng)，倒置顯微鏡下化學(xué)熒光法鑒定為平滑肌細(xì)胞。制備大鼠不同組含藥血清并加入第3-7代ASMCs中干預(yù)。運用MTT法檢測各組ASMCs增殖水平（OD值）。結(jié)果ELISA法結(jié)果，與模型組相比，西藥治療組、咳喘寧各劑量組血清IL-4、IFN-γ水平差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與咳喘寧大、小劑量組相比，中劑量組血清IL-4、IFN-γ水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MTT法結(jié)果，與空白對照組比較，其余5組差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與咳喘寧大、小劑量血清中比較，中劑量血清組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論咳喘寧對治療RSV誘發(fā)的哮喘大鼠療效較為顯著，通過上調(diào)IFN-r水平、降低IL-4水平表達(dá)從而降低氣道炎癥反應(yīng)，維持Th1/Th2平衡來調(diào)節(jié)機體免疫機制?？却瓕幹委熤夤芟赡芘c其能夠抑制氣道平滑肌增殖、影響哮喘氣道重塑關(guān)系密切。

咳喘寧；哮喘；白介素-4；干擾素-γ；氣道平滑肌細(xì)胞

支氣管哮喘簡稱哮喘(asthma)，是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病［1］，也是兒童時期常見的呼吸道變應(yīng)性炎癥疾病［2］。在諸多致哮喘病因中，病毒感染是誘發(fā)兒童哮喘最常見的原因，有研究顯示［3]，85%的兒童哮喘急性發(fā)作與病毒感染有關(guān)，呼吸道合胞病毒（RSV）感染所致者可高達(dá)78.49%，是兒童哮喘急性發(fā)作時的主要病原體［4］。病毒也是引起哮喘急性加重與惡化的重要因素，且參與所有年齡的哮喘加重［5]。氣道重塑能夠引起氣道不可逆狹窄和氣道持續(xù)高反應(yīng)性，成為氣流不可逆阻塞和哮喘反復(fù)發(fā)作的病理基礎(chǔ)［6］。而這種不可逆性氣道狹窄主要是由氣道平滑肌細(xì)胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)異常增殖引起的。

目前，西醫(yī)治療哮喘首推糖皮質(zhì)激素和β2受體激動劑，其中糖皮質(zhì)激素對氣道重塑抑制作用明確，但長期或大量應(yīng)用可能引起一系列的副作用［7］，故尋求中醫(yī)藥干預(yù)病毒誘發(fā)哮喘免疫機制及氣道重塑的研究成為哮喘研究的重要課題。本課題選用了由哮喘經(jīng)驗方研制而成的咳喘寧口服液，通過觀察咳喘寧對RSV誘發(fā)哮喘大鼠血清IL-4、IFN-γ的調(diào)節(jié)作用及對ASMCs增殖水平（OD值）的影響，明確咳喘寧治療哮喘的免疫機制及其抑制RSV誘導(dǎo)ASMCs增殖的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物大鼠60只（潔凈級、雄性、120～180 g、28～42 d，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心供給）。所有動物均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室。

1.2實驗用藥咳喘寧口服液：麻黃、黃芪、杏仁、桃仁、石膏、大青葉、細(xì)茶葉、甘草。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供[（湘）衛(wèi)藥劑（06）05第085100號]，批號:201405，100 mL/瓶，含50g生藥。對照藥物：硫酸沙丁胺醇片（姑蘇弘森藥業(yè)有限公司，批號：022150404）；醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：20140515）。

1.3主要儀器和試劑

1.3.1主要試劑雞卵清白蛋白（OVA）（上海麗珠東風(fēng)技術(shù)有限公司）；呼吸道合胞病毒（武漢市武昌區(qū)華東試驗試劑公司）；PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；4%多聚甲醛（北京鼎園公司）；大鼠白介素-4、擾素-γ酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海天晶生物科技有限公司）；D-Hanks液（南京森貝伽生物科技有限公司）；Ⅰ型膠原型（上海谷研科技有限公司）；牛血清白蛋白（成都瑞芬思）；木瓜蛋白酶（源葉生物）；DMEM（Gibco CM995）；優(yōu)級胎牛血清（天津市海洋生物有限責(zé)任公司）；胰蛋白酶/EDTA消化液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）；青霉素-鏈霉素雙抗（ST488）；MTT液（ST316）；細(xì)胞鑒定試劑:大鼠抗α-actin單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒（二抗）（上海研域生物科技有限公司）。

1.3.2主要儀器醫(yī)用超聲霧化（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；霧化器（湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院細(xì)胞培養(yǎng)室提供：離心機、酶標(biāo)儀、冰箱、自動純水雙蒸器、倒置顯微鏡，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞培養(yǎng)板等。

2　方法

2.1哮喘模型制備與分組

采用我科已建立的方法［8］,并參照文獻(xiàn)［9］造模。除正常組10只外，其余大鼠于第1天和第8天分3處注射（兩下肢內(nèi)側(cè)皮下各注射0.25 mL，腹腔注射0.5 mL）由PBS稀釋的1 mL無菌抗原液（含10 mg卵清白蛋白+100 mg氫氧化鋁凝膠）致敏，正常組注射PBS致敏；第9天至第21天為激發(fā)階段，將大鼠放入容積為10 L的霧化箱內(nèi)（內(nèi)有一霧化氣孔和一通氣孔），通過超聲霧化器以1%卵清白蛋白生理鹽水溶液20 mL霧化，每次20 min，隔天霧化1次，連續(xù)2周；觀察大鼠精神、飲食、活動及呼吸，如發(fā)現(xiàn)大鼠精神變差、飲食減少、活動減少、呼吸頻率加快的現(xiàn)象，提示激發(fā)成功,停止激發(fā)；第21、35、49天以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后再以滴度為1.0×106空斑形成單位的RSV 50μL經(jīng)鼻腔滴入使大鼠感染RSV誘發(fā)哮喘，經(jīng)RSV滴鼻的大鼠出現(xiàn)噴嚏、鼻腔有少量卡他樣無色透明分泌物、弓肩聳背、點頭樣呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不穩(wěn)時即為哮喘急性發(fā)作，提示造模成功。正常組以生理鹽水進行霧化及滴鼻。

2.2中藥血清制備

選取9只大鼠隨機分成3組，分別為：咳喘寧大、中、小劑量組。藥物配制：咳喘寧口服液30 mL，大中小劑量組給藥劑量相當(dāng)于兒童（體質(zhì)量）每日用量的1、5、10倍（按比例計算）。中劑量為大劑量1 mL加蒸餾水4 mL，小劑量為中劑量1 mL加蒸餾水4 mL。大鼠預(yù)先禁食12 h，灌胃給予相應(yīng)藥物及蒸餾水，2 h及3 h后各加強給藥1次。10%水合氯醛麻醉，無菌條件下自心臟采血，離心血清（3 000 r/min，20 min，4℃），血清56℃下30 min滅活，分裝于EP管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3在體實驗

2.3.1干預(yù)與標(biāo)本提取造模大鼠分為5組，分別為：哮喘模型組，潑尼松與沙丁胺醇混懸液治療組（簡稱西藥治療組），咳喘寧大、中、小劑量組。各干預(yù)組在造模完成當(dāng)天（即第49天）開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d，直至處死。按照《中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)》，體表面積-劑量換算法，將人臨床用藥劑量折算為大鼠用藥劑量，各組藥物用量如下：西藥治療組予混懸液醋酸潑尼松7.0 mg/（kg·d）、沙丁胺醇片劑1.1 mg/（kg·d），咳喘寧大劑量組5.0 g/（kg·d），咳喘寧中劑量組2.5 g/（kg·d），咳喘寧小劑量組1.25 g/（kg·d），正常組及模型組予蒸餾水灌胃，每日灌胃1次。各治療組藥物均以蒸餾水稀釋，各組灌胃容量均為10 mL/（kg·d）。

2.3.2ELISA法檢測IL-4、IFN-γ最后一次灌胃治療后，稱量各組大鼠體質(zhì)量，以10%水合氯醛3.0 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠。然后打開腹腔，腹主動脈取血4 mL，標(biāo)本由無菌干燥管收集，靜置20 min后，4℃2 000 r/min離心，10 min，分離血清，-20℃以下保存。取材測定過程中，由于血清量過少、分離不純、蛋白質(zhì)凝集沉淀現(xiàn)象等原因?qū)е虏糠謽?biāo)本不合格，故各組均只選取7個標(biāo)本結(jié)果進行比較。取冰凍血清樣本，室溫下融解，采用ELISA法定量檢測，嚴(yán)格按試劑盒操作，測量血清IL-4和IFN-γ值。

2.4體外實驗

2.4.1ASMCss的分離、培養(yǎng)及鑒定哮喘模型組和正常組于造模成功后分別取支氣管平滑肌進行細(xì)胞培養(yǎng)，參照文獻(xiàn)［10-12］并改良方法，先用10%水合氯醛（4.0 mL/kg）腹腔注射處死大鼠，后以75%酒精消毒表皮，從腹部至頸部依次剪開皮膚、肌肉，腹主動脈放血后剪開胸腔，從頸部往下迅速分離出氣管與肺部組織，剪去心臟，將氣管及肺組織轉(zhuǎn)移至含有DHanks液培養(yǎng)皿，D-Hanks液漂洗2次，用角膜剪仔細(xì)剔除支氣管周圍結(jié)締組織、血管等，沿支氣管縱軸剪開管腔，用手術(shù)刀刮除內(nèi)外膜，直至氣管接近透明，用眼科虹膜剪將氣管段剪成1 mm或以下的組織塊。將剪好組織塊裝入15 mL離心管中，加入配制好的I型膠原酶溶液2 mL（用D-Hanks液配制成含I型膠原酶消化液2 mg/mL、木瓜蛋白酶2.5 mg/mL、牛血清白蛋白2.5 mg/mL的溶液），玻璃滴管反復(fù)輕輕吹打混勻，37℃，5%CO2孵箱中消化30 min，取出后用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，將離心管800 r/min離心5 min，靜置2 min后，棄上清，再加0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA溶液2 mL，以同樣方法消化15 min，離心去上清，加入含有20% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM液，吹打20次后，靜置10 min，將上層液轉(zhuǎn)移至25 mL培養(yǎng)瓶，繼續(xù)吹打離心管下層組織塊，靜置，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，重復(fù)幾次，直至組織塊盡可能分離，最后全部裝入培養(yǎng)瓶。2 d換液1次。細(xì)胞鋪滿瓶底90%進行傳代。實驗用3代細(xì)胞，在倒置顯微鏡下，細(xì)胞通過形態(tài)學(xué)觀察并經(jīng)α-action免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性，鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞。

2.4.2MTT檢測各組大鼠ASMCs的增殖水平取第3-7代培養(yǎng)的大鼠ASMCs，0.25%胰蛋白酶/ 0.02%EDTA溶液2 mL，消化10 min，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)24 h后，換無血清DMEM培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長同步于G0期，換用含10%FBS的DMEM液，隨機分為6組：空白對照組：培養(yǎng)的正常大鼠ASMCs，每孔/瓶中加入DMEM干預(yù)；哮喘模型組：培養(yǎng)的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中加入DMEM干預(yù)；西藥治療組：培養(yǎng)的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中加入等劑量沙丁胺醇+潑尼松溶液（終濃度為10 nmol/L）；咳喘寧大、中、小劑量血清組：培養(yǎng)的哮喘大鼠ASMCs，每孔/瓶中，分別加入大、中、小劑量咳喘寧血清，給藥劑量分別為12.5 g/（kg·d）、6.25 g/（kg·d）、1.25 g/（kg·d）。每4個復(fù)孔/瓶為一組，培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT（5 mg/mL）50μL，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱4 h后去除上清，實驗重復(fù)3次，然后加入二甲基亞砜150μL，震蕩10 min后，酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm處測定各孔吸光度（OD）值。

2.5統(tǒng)計學(xué)分析

3　結(jié)果

3.1酶聯(lián)免疫檢測各組大鼠血清IL-4、IFN-γ的表達(dá)變化

與正常組比較，哮喘模型組血清IL-4值明顯升高、血清IFN-γ值明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與哮喘模型組相比，西藥治療組、咳喘寧各劑量組血清IL-4明顯降低、IFN-γ明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與西藥治療組比較，咳喘寧中、小劑量組血清IL-4、IFN-γ值無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與大、小劑量組相比，中劑量組血清IL-4值降低較為明顯、IFN-γ值相對升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　各組大鼠血清IL-4、IFN-γ結(jié)果（±s,n=7,pg/mL）

表1　各組大鼠血清IL-4、IFN-γ結(jié)果（±s,n=7,pg/mL）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05；與大、小劑量組比較，◆P＜0.05。

組別正常組模型組西藥治療組咳喘寧小劑量組咳喘寧中劑量組咳喘寧大劑量組F值P值劑量--7mg(潑)+1.1mg（沙）/（kg·d）1.25 g/(kg·d) 2.5 g/(kg·d) 5.0 g/(kg·d) IL-4 17.97±0.54 34.28±3.45★★15.87±1.10＃14.57±2.16＃14.08±1.56?！?9.67±1.31＃41.09＜0.01 IFN-γ 52.28±1.77 34.72±1.24★★47.76±4.37＃43.20±6.20＃48.24±3.46＃◆46.97±3.23＃14.62＜0.01

3.2細(xì)胞鑒定

在倒置顯微鏡（×100）下，經(jīng)原代培養(yǎng)的ASMCs呈梭形，有較長的突起，圓形的細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈疏密相間、典型“峰和谷”生長狀態(tài)。a-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。97%細(xì)胞a-actin染色陽性，所培養(yǎng)的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞（見圖1）。

3.3各組ASMCs增殖水平（OD值）

與空白對照組比較，其余5組差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與哮喘模型組比較，其余五組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與沙潑干預(yù)組比較，咳喘寧大劑量血清組、中劑量組、小劑組組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與咳喘寧大、小劑量血清中比較，中劑量血清組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1　大鼠ASMCs a-actin染色顯微光鏡圖（×100）

表2　各組ASMCs增殖水平光密度值（OD值）（±s）

表2　各組ASMCs增殖水平光密度值（OD值）（±s）

注：與空白對照組比較，★★P＜0.01；與哮喘模型組比較，＃P＜0.05；與大、小劑量組比較，◆P＜0.05。

組別復(fù)孔OD值空白對照組4 0.74±0.05＃哮喘模型組4 1.00±0.04★★西藥治療組4 0.54±0.03★★?？却瓕幮┝垦褰M4 0.61±0.04★★＃咳喘寧中劑量血清組4 0.51±0.03★★?！艨却瓕幋髣┝垦褰M4 0.58±0.03★★＃F值93.9 P值＜0.01

4　討論

支氣管哮喘屬中醫(yī)學(xué)“哮證”“齁喘”等領(lǐng)域?！兜は姆ā肥紫让麨椤跋保岢觥跋瓕Ｖ饔谔怠?。歷代治喘名家都很重視伏痰在哮喘中的作用，將哮喘的發(fā)病機制概括為“外因誘發(fā)，觸動伏痰，痰隨氣升，氣因痰阻，相互搏結(jié)于氣道”。自古以來，中醫(yī)藥防治哮喘有著豐富的經(jīng)驗，具有療效顯著、方式多樣、副作用小等優(yōu)勢。

本實驗以哮喘實驗動物模型為載體，從動物整體水平研究中藥治療哮喘的作用機制。選用的咳喘寧口服液是由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科主任根據(jù)病毒誘發(fā)兒童哮喘的機理，以清熱化痰平喘的傳統(tǒng)古方五虎湯為基本方研制而成。方中君藥為麻黃和苦杏仁，功在調(diào)暢肺氣、止咳平喘、祛除伏痰；黃芪、石膏、大青葉，三者共為臣藥，合用以清除哮喘激發(fā)因素、提高機體免疫力；桃仁、細(xì)茶葉、甘草三藥共為佐使，共奏宣肺化痰、止咳平喘、扶正祛邪、清熱解毒之良效。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，亦能清除哮喘激發(fā)因素、降低氣道反應(yīng)、抑制氣道重塑等，從而防治哮喘［13］。

本實驗證實，咳喘寧口服液，尤其是中劑量組對治療RSV誘發(fā)的哮喘大鼠療效較為顯著，通過上調(diào)IFN-r水平、降低IL-4水平表達(dá)從而降低氣道炎癥反應(yīng)，維持Th1/Th2平衡來調(diào)節(jié)機體免疫?？却瓕幹委熤夤芟赡芘c其能夠抑制氣道平滑肌增殖、影響哮喘氣道重塑關(guān)系密切，同時也為“伏痰、瘀”理論在病毒誘發(fā)哮喘中的作用機制提供了實驗依據(jù)。

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（本文編輯 楊瑛）

Effect of Kechuanning on Serum IL-4 and IFN-γin RSV Induced Asthma Rats and Its Role in ASMC Proliferation

TAN Wei1,LI Ying2*,LUO Yinhe2,WANG Mengqing2,SHU Lan2,TANG Liqiong1,GONG Ximei1, LI Ping1,TAO Hong2,PENG Xinxin2
(1.Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China; 2.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To observe the regulating effect of Kechuan Ning on serum IL-4,IFN and the proliferation of airway smooth muscle cells(ASMCs)level(OD level)in RSV induced asthma rats.And to provide experimental basis for the prevention and treatment of asthma. Methods The 60 rats were randomly divided into 6 groups.Except the normal group,the other rats were induced asthma by sensitization and virus to making models.On the day of succesful modeling,the IL-4 and IFN-γ were determined by ELISA.The smooth muscle cells were cultured and the smooth muscle cells were identified as smooth muscle cells by inverted microscope.The containing serum groups were prepared and added ASMCs at 3-7 passages.The proliferation of ASMCs(OD value was determined by MTT method.Results The ELISA result shows that the serum levels of IL-4 and IFN-γ levels in the Western medicine group and Kechuanning group were with statistical significance comparing with the model group(P＜0.05).Compared with high dose and low dose groups,the serum levels of IL-4 and IFN-γ levels had statistic significance(P＜0.05).MTT assay shows that the rest of five groups had statistical significance comparingthe blank control group(P＜0.01).Compared with the large-dose and small-dose serum groups,the difference in medium-dose serum group was significant statistically(P＜0.05).Conclusion Kechuanning shows obviuos effect on treatment of RSV induced asthma rats.The airway inflammation is reduced by upregulating IFN-γ level and reducing IL-4 level expression,the body immune system is regulated by maintaining the balance of Th1/Th2.Kechuanning in treatment of bronchial asthma may be closely related to the inhibition of airway smooth muscle proliferation and influence of airway remodeling.

Kechuanning;asthma;interleukin-4;interferon-γ;airway smooth muscle cells

R285.5；R256.12

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.11.002

2016-07-06

國家自然科學(xué)基金（81674025）；湖南省自然科學(xué)基金（14JJ3120）。

譚維,女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)小兒肺系疾病。

*李英，女，講師，博士，E-mail：120812828@qq.com。