毛細(xì)管電泳基因掃描和凝膠電泳異源雙鏈分析在免疫球蛋白/T細(xì)胞受體基因重排檢測(cè)中的應(yīng)用研究*

陳杰 鄭可 張文燕 孫林雍 唐源 嚴(yán)嘉琦 趙莎 劉衛(wèi)平

(四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科， 四川 成都 610041)

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·論著·

毛細(xì)管電泳基因掃描和凝膠電泳異源雙鏈分析在免疫球蛋白/T細(xì)胞受體基因重排檢測(cè)中的應(yīng)用研究*

陳杰 鄭可 張文燕 孫林雍 唐源 嚴(yán)嘉琦 趙莎 劉衛(wèi)平

(四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科， 四川 成都 610041)

目的 探討免疫球蛋白輕鏈IgK及T細(xì)胞抗原受體(TCRγ)基因重排更有效的檢測(cè)方法。 方法 收集四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科2013～2014年淋巴組織增生性病變石蠟樣本共139例，采用BIOMED-2系統(tǒng)擴(kuò)增，分別使用毛細(xì)管電泳基因掃描和凝膠電泳異源雙鏈分析兩種方法進(jìn)行IgK和TCRγ基因重排檢測(cè)，比較不同方法之間的檢出率。 結(jié)果 81例行IgK基因重排檢測(cè)，其中59例病理診斷為B細(xì)胞淋巴瘤，毛細(xì)管電泳基因掃描檢出陽性47例(79.66%)，凝膠電泳異源雙鏈分析檢出陽性34例(57.63%)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。58例行TCRγ基因重排檢測(cè)，其中26例病理診斷為T細(xì)胞淋巴瘤，毛細(xì)管電泳基因掃描檢出陽性21例(80.77%)，凝膠電泳異源雙鏈檢出陽性17例(65.38%)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.211)。 結(jié)論 毛細(xì)管電泳基因掃描在抗原受體基因重排檢測(cè)中比凝膠電泳異源雙鏈分析有更好的檢測(cè)靈敏度。

毛細(xì)管電泳; 凝膠電泳; 基因重排; BIOMED-2系統(tǒng)

免疫球蛋白(Immunoglobin, Ig)和T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)基因重排檢測(cè)是淋巴組織增生性疾病的重要輔助診斷手段，其基本原理是淋巴組織腫瘤起源于單個(gè)惡性轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞，相同的克隆具有相同的基因重排方式。因此，淋巴組織增生克隆性分析的常用檢測(cè)方法，常規(guī)用于石蠟包埋組織。四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科分子病理室采用BIOMED-2標(biāo)準(zhǔn)化的Ig和TCR基因重排克隆性分析系統(tǒng)合成引物并行擴(kuò)增反應(yīng)，其結(jié)果分析采用聚丙烯酰胺凝膠跑電泳結(jié)合異源雙鏈分析檢測(cè)目標(biāo)條帶[1-2]；在2014年逐步替換為毛細(xì)管電泳基因掃描，使用InVivoScribe Technologies公司商品化試劑進(jìn)行Biomed-2擴(kuò)增，擴(kuò)增后使用ABI3500基因分析儀行毛細(xì)管電泳，檢測(cè)其目標(biāo)擴(kuò)增峰[3]。本文將對(duì)比毛細(xì)管電泳基因掃描和凝膠電泳異源雙鏈分析兩種方法在抗原受體基因重排檢測(cè)中的差異。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科2013～2014年淋巴組織增生性病變139例，均為10%中性緩沖福爾馬林固定石蠟包埋組織樣本。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 使用QIAGEN FFPE DNA提取試劑盒提取DNA；并檢查濃度備測(cè)。擴(kuò)增管家基因β-globin檢測(cè)其質(zhì)量。

1.2.2 引物 室內(nèi)合成引物和商品化試劑盒的引物相同：IgK： Vk1f/6， Vk2f，Vk3f，Vk4，Vk5，Vk7，Jk1-4，Jk5，Kde，InTR；TCRγ：Vr1f，Vr10，Vr9，Vr11，Jr1.1/2.1，Jr1.3/2.3。

1.2.3 凝膠電泳異源雙鏈分析 所有樣本均使用天根公司商品化BufferMix加Taq酶及室內(nèi)合成的引物配制反應(yīng)體系，進(jìn)行Biomed-2擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后行異源雙鏈分析，最后使用聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶。

1.2.4 毛細(xì)管電泳基因掃描法 所有樣本均使用InVivoScribe Technologies公司的IdentiCloneTMIGK Gene Clonality Assay、IdentiCloneTMTCRγ Gene Clonality Assay試劑盒及ABI公司的AmpliTaq Gold Taq酶配制反應(yīng)體系，進(jìn)行Biomed-2擴(kuò)增，隨后配制檢測(cè)體系行異源雙鏈分析，使用ABI3500基因分析儀跑毛細(xì)管電泳，結(jié)果使用GeneMapper軟件進(jìn)行分析。兩種方法均使用相同的IgK及TCRγ陽性和陰性對(duì)照品，空白對(duì)照使用滅菌去離子水。

1.3 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn) 兩種方法的擴(kuò)增片段范圍一致。IgK TubeA擴(kuò)增條帶/擴(kuò)增峰范圍：120～160 bp、190～210 bp、260～300 bp，TubeB為：210～250 bp、270～300 bp、350～390 bp；TCRγ TubeA擴(kuò)增條帶/擴(kuò)增峰范圍：145～255 bp，TubeB為80～220 bp。凝膠電泳異源雙鏈分析的結(jié)果在目標(biāo)片段范圍內(nèi)可見清晰條帶，邊緣整齊，寬<1 mm，視為有克隆性重排；若條帶顯色較弱視為弱陽性；呈現(xiàn)涂片狀(smear)則為陰性[4]。毛細(xì)管電泳基因掃描的結(jié)果在目標(biāo)片段范圍內(nèi)查見明顯的尖銳擴(kuò)增峰，且峰高超過10 000可視為有克隆性重排；若擴(kuò)增峰高度在10 000以下視為弱陽性；若呈現(xiàn)連續(xù)的波浪小峰或者數(shù)個(gè)低矮雜亂峰、甚至無峰出現(xiàn)則為陰性[3]。IgK檢測(cè)中其TubeA反應(yīng)結(jié)果會(huì)在146 bp處出現(xiàn)一高度在10 000以內(nèi)的非特異性擴(kuò)增峰，應(yīng)不納入判讀范圍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組結(jié)果比較采用2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理診斷 139例樣本的病理診斷為B細(xì)胞淋巴瘤62例，T細(xì)胞淋巴瘤31例，霍奇金淋巴瘤9例，不典型淋巴組織增生9例，炎性病變(包括Kikuchi病)9例，淋巴組織反應(yīng)性增生12例，EB病毒相關(guān)淋巴增生性病變3例，Langerhans細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥1例，脾臟淤血伴髓外造血1例，骨髓造血細(xì)胞增生活躍2例。

2.2 DNA質(zhì)量檢測(cè) 提取的DNA經(jīng)質(zhì)控引物擴(kuò)增均獲得100～400 bp目標(biāo)條帶，符合檢測(cè)要求。

2.3 IgK和TCR基因重排檢測(cè)結(jié)果 139例樣本中81例進(jìn)行了IgK基因重排檢測(cè)，48例(59.26%)毛細(xì)管電泳基因掃描檢出克隆性重排，35例(43.21%)凝膠電泳異源雙鏈分析法檢出克隆性。58例進(jìn)行了TCR基因重排檢測(cè)，32例(55.17%)毛細(xì)管電泳基因掃描檢出克隆性重排(表1)。

2.4 B細(xì)胞淋巴瘤的IgK和TCR基因重排檢測(cè)結(jié)果 62例B細(xì)胞淋巴瘤，其中59例用兩種方法同時(shí)進(jìn)行了IgK檢測(cè)，毛細(xì)管電泳基因掃描法檢出克隆性重排47例(79.66%)，凝膠電泳異源雙鏈分析法檢出克隆性重排34例(57.63%)(圖1)。兩組結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外3例同時(shí)進(jìn)行了TCRγ基因檢測(cè)，均未檢出克隆性重排。

2.5 T細(xì)胞淋巴瘤的IgK和TCR基因重排檢測(cè)結(jié)果 31例T細(xì)胞淋巴瘤，其中26例用兩種方法同時(shí)進(jìn)行了TCRγ基因重排檢測(cè)，毛細(xì)管電泳基因掃描檢出克隆性重排21例(80.77%)，凝膠電泳異源雙鏈檢出克隆性重排17例(65.38%)(圖2)。2檢驗(yàn)比較顯示二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.211)。余5例行IgK基因重排檢測(cè)，均未檢出克隆性重排。

表1 139例淋巴組織增生性病變IgK/TCR基因重排檢測(cè)結(jié)果[n(×10-2)]

注：ND：未檢測(cè)；MALToma:黏膜相關(guān)淋巴組織結(jié)外邊緣區(qū)淋巴瘤。

圖1 彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤基因重排檢測(cè)結(jié)果

Figure 1 Positive results of Igk in diffuse large B cell lymphoma by capillary electrophoresis and gel electrophoresis

注：A.毛細(xì)管電泳TubeA在120～160 bp及260～300 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增峰，TubeB在270～300 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增峰；B.凝膠電泳TubeA在120～160 bp及260～300 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增條帶，TubeB在270～300 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增條帶。

圖2 淋巴組織反應(yīng)性增生基因重排檢測(cè)結(jié)果

Figure 2 Negative results of Igk in reactive hyperplasia by capillary electrophoresis and gel electrophoresis

注：A.毛細(xì)管電泳；B.凝膠電泳；兩種方法TubeA、TubeB在目標(biāo)范圍內(nèi)均未查見克隆性擴(kuò)增峰/擴(kuò)增條帶。

圖3 外周T細(xì)胞淋巴瘤基因重排檢測(cè)結(jié)果(非特指)

Figure 3 Positive results of TCRγ in peripheral T cell lymphoma by capillary electrophoresis and gel electrophoresis

注：A.毛細(xì)管電泳TubeA在145～255 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增峰，TubeB在80～220 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增峰;B.凝膠電泳TubeA在145～255 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增條帶,TubeB在80～220 bp范圍內(nèi)見克隆性擴(kuò)增條帶.

2.6 其他淋巴組織增生性疾病的IgK和TCR基因重排檢測(cè)結(jié)果 12例反應(yīng)性增生，7例行IgK檢測(cè)，其中毛細(xì)管電泳基恩掃描陽性1例(14.29%)，凝膠電泳異源雙鏈結(jié)果為陰性(圖3)；5例進(jìn)行了TCRr檢測(cè)，其中毛細(xì)管電泳基因掃描檢出陽性2例(40%)，凝膠電泳異源雙鏈檢出陽性1例(20%)，余為陰性(圖4)。

3 討論

B或T淋巴細(xì)胞在分化成熟過程中免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因發(fā)生重排，形成數(shù)目龐大的不同克隆。與反應(yīng)增生淋巴組織中的多克隆淋巴細(xì)胞不同，淋巴瘤的發(fā)生被認(rèn)為是B或T淋巴細(xì)胞被阻斷在其分化過程中某一階段而造成淋巴細(xì)胞的克隆性增生所致，淋巴瘤腫瘤細(xì)胞來自于同一克隆(少數(shù)為寡克隆)，具有一致的基因重排。多數(shù)淋巴增生性疾病通過組織形態(tài)學(xué)觀察及免疫表型分析能夠明確診斷，但仍有5%～10%的病例需要通過分子水平的克隆性分析來協(xié)助確定病變性質(zhì)。早在1990年就已經(jīng)將PCR技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞基因重排以助判斷其增生的克隆性，但由于引物覆蓋率低，致使很多假陰性出現(xiàn)。為解決引物設(shè)計(jì)所致的假陰性，并標(biāo)準(zhǔn)化該項(xiàng)PCR檢測(cè)技術(shù)，歐洲7個(gè)國家47家研究所組織了“歐洲BIOMED-2協(xié)同研究”，成功設(shè)計(jì)出了BIOMED-2系統(tǒng)，該系統(tǒng)設(shè)計(jì)了107種引物，被組合在18個(gè)多重引物擴(kuò)增管中且具有互補(bǔ)性，可以檢測(cè)出幾乎全部的B細(xì)胞、T細(xì)胞基因重排片段。后續(xù)的大量研究證實(shí)BIOMED-2系統(tǒng)被適用于各種亞型淋巴瘤的基因重排檢測(cè)[5-19]。

圖4 淋巴組織反應(yīng)性增生基因重排檢測(cè)結(jié)果

Figure 4 Negative results of TCRγ in reactive hyperplasia by capillary electrophoresis and gel electrophoresis

注：A.毛細(xì)管電泳，B.凝膠電泳；兩種方法TubeA、TubeB在目標(biāo)范圍內(nèi)均未查見克隆性擴(kuò)增峰/擴(kuò)增條帶。

本研究采用BIOMED-2系統(tǒng)中IgK及TCRγ引物組合進(jìn)行基因重排檢測(cè)，所有139例樣本內(nèi)參質(zhì)控引物擴(kuò)增均得到300 bp以上的產(chǎn)物，均符合BIOMED-2系統(tǒng)片段范圍。在進(jìn)行IgK基因重排檢測(cè)的81樣本中，59例最終診斷為B細(xì)胞淋巴瘤，包括彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等七種亞型，毛細(xì)管電泳基因掃描檢出陽性47例(79.66%)，而凝膠電泳異源雙鏈分析檢出陽性34例(57.63%)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上兩種方法差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01)。在進(jìn)行TCRγ基因重排檢測(cè)的59樣本中，26例最終診斷為T細(xì)胞淋巴瘤，包括NK/T細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤(非特指)、間變性大細(xì)胞淋巴瘤等六種亞型，毛細(xì)管電泳基因掃描檢出陽性21例(80.77%)，凝膠電泳異源雙鏈檢出陽性17例(65.38%)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上兩種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.211)。上述結(jié)果提示B細(xì)胞淋巴瘤的IgH基因重排檢測(cè)，毛細(xì)管電泳基因掃描更加敏感、檢出率更高。就其可能的原因，包括：凝膠電泳使用的是室內(nèi)合成引物，由于引物在合成、配制中存在諸多影響因素，反復(fù)凍融亦會(huì)導(dǎo)致引物降解、擴(kuò)增效率變低，以至于在BIOMED-2擴(kuò)增后觀察不到明確的克隆性條帶；而毛細(xì)管電泳使用的商品化試劑盒，其引物、Buffer等均為標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的，其試劑穩(wěn)定性更好，擴(kuò)增效率更好。凝膠電泳結(jié)果采用聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過電泳后，使用銀染法顯色觀察，聚丙烯酰胺凝膠配制的好壞，染色、顯色的質(zhì)量均直接影響到結(jié)果判斷，且聚丙烯酰胺凝膠需肉眼觀察，受限于分辨率，其結(jié)果存在不確定性。而使用毛細(xì)管電泳檢測(cè)進(jìn)行的是片段的分析，PCR產(chǎn)物在毛細(xì)管中電泳，經(jīng)激光照射后由信號(hào)收集器收集熒光信號(hào)，最后由軟件自動(dòng)計(jì)算并以擴(kuò)增峰的形式顯示結(jié)果，其結(jié)果可以明確知道每個(gè)擴(kuò)增片段的條帶位置及擴(kuò)增峰高度，即使少量的擴(kuò)增片段亦可以收集到激光信號(hào)，敏感性和準(zhǔn)確性均高于聚丙烯凝膠電泳。

12例淋巴組織反應(yīng)性增生樣本中7例進(jìn)行IgK檢測(cè)，毛細(xì)管電泳檢出陽性1例；5例進(jìn)行TCRγ檢測(cè)，毛細(xì)管電泳檢出陽性2例，凝膠電泳檢出陽性1例。盡管例數(shù)不多，但是沒有呈現(xiàn)毛細(xì)管電泳基因掃描檢測(cè)基因重排的過度敏感或假陽性增加的趨勢(shì)。

4 結(jié)論

本研究通過同一組病例的兩種實(shí)驗(yàn)方法比較結(jié)果表明：毛細(xì)管電泳基因掃描因采用并經(jīng)過相關(guān)衛(wèi)生管理機(jī)構(gòu)認(rèn)證的商品化試劑盒，具有很強(qiáng)的規(guī)范性和穩(wěn)定性，較傳統(tǒng)的凝膠電泳異源雙鏈分析有更高的檢測(cè)靈敏度，更好的陽性檢出率；可以減少重復(fù)率提高工作效率；能夠提高淋巴瘤基因重排的檢測(cè)準(zhǔn)確率，是實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化的最佳選擇。

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Comparative study of capillary electrophoresis-genescan and polyacrylamide gel electrophoresis-heteroduplex polymorphism in detecting IG/TCR gene rearrangement

CHEN Jie，ZHENG Ke，ZHANG Wenyan,et al

(DepartmentofPathology，WestChinaHospital，Sichuanuniversity，Chengdu610041，China)

Objective To compare the sensitivity of immunoglobulin heavy chain (IGH) gene rearrangement, immunoglobulin light chain(IgK) rearrangement and TCRγ gene clonal rearrangment by capillary electrophoresis (CE)-genescan and polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)-heteroduplex polymorphism, then establish a more effective method in detecting gene rearrangement. Methods DNA was extracted from paraffin embedded tissues in 139 patients of lymphoproliferative disease which collected from Department of Pathology, West China Hospital of Sichuan University in the period of 2013 to 2014. Clonal gene rearrangement was detected by PAGE-heteroduplex polymorphism and CE-genescan and compare the sensitivity of the two methods. Results 81 patients were positive for IgK rearrangement. 59 cases were diagnosed as B-cell lymphomas. 47 cases (79.66%) were positive for IgK rearragement by CE-genescan, whereas the positive rate was 57.63% by PAGE-heteroduplex polymorphism. 58 cases were positive for T-cell receptor (TCRγ) gene rearrangement. 26 of these were diagnosed as T-cell lymphomas. 80.77% (21/26) and 65.38%(17/26) TCRγ clonality were detected by CE-genescan and by PAGE-heteroduplex polymorphism, respectively. In composition, The positive rate of the former was higher than that of the latter, and there was a significant difference in the IgH rearrangement (P=0.01 ), while there was no significant difference in TCRγ rearrangement (P=0.211 ). Conclusion CE-genescan has a higher detecting sensitivity to antigen receptor gene rearrangement than PAGE-heteroduplex polymorphism. It’s an efficient detection of gene rearrangement.

Capillary electrophoresis; Gel electrophoresis; Gene rearrangement; BIOMED-2 system

國家自然科學(xué)基金(81272626)

張文燕，教授，本刊審稿專家，E-mail:zhangwenyanpath@163.com

R-331; R 733

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.11.003

2016-07-26; 編輯： 張文秀)