桃核承氣湯對(duì)慢性腎衰大鼠BMP-7及MMP-2表達(dá)影響的研究

莊秀輝，張喜奎，危美紅，蘇美玲

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州350003）

桃核承氣湯對(duì)慢性腎衰大鼠BMP-7及MMP-2表達(dá)影響的研究

莊秀輝1，張喜奎2，危美紅1，蘇美玲1

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建福州350003）

目的觀察桃核承氣湯對(duì)5／6腎切除大鼠BMP-7、MMP-2及TIMP-2表達(dá)的影響，探討該方治療慢性腎衰（CRF）的療效機(jī)制。方法將5／6腎切除制造CRF大鼠模型，全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀測(cè)血常規(guī)，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)腎功能，免疫組化法測(cè)BMP-7、MMP-2及TIMP-2蛋白的表達(dá)，Real－Time PCR法測(cè)BMP-7及MMP-2 m RNA的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行光鏡觀察。結(jié)果與模型組比較，治療組能顯著升高RBC和HB（P＜0.05），顯著降低血Scr和BUN（P＜0.05），明顯提高BMP-7、MMP-2蛋白及m RNA的表達(dá)而抑制TIMP-2蛋白的表達(dá)（P＜0.05），并能在病理上減輕腎間質(zhì)纖維化程度。結(jié)論桃核承氣湯可通過(guò)上調(diào)BMP-7、MMP-2蛋白及mRNA的表達(dá)，而下調(diào)TIMP-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而減輕腎間質(zhì)纖維化，延緩CRF進(jìn)展。

腎間質(zhì)纖維化；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；桃核承氣湯

桃核承氣湯是治療太陽(yáng)蓄血輕證的經(jīng)方，經(jīng)臨床觀察及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：該方能改善腎功能，糾正貧血，延緩慢性腎衰（CRF）進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)采用5／6腎切除方法制造CRF模型，通過(guò)觀察桃核承氣湯對(duì)5／6腎切除大鼠腎組織BMP-7、MMP-2及TIMP-2表達(dá)的影響，探討該方治療CRF的療效機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物7周齡SPF級(jí)的雄性SD大鼠60只，體重180～200 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司［許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002，動(dòng)物合格證編號(hào)：2013001805578］，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SYXK（閩）2014-0005］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物桃核承氣湯：生大黃12 g（后入），芒硝6 g（熔服），桃仁12 g，桂枝6 g，炙甘草6 g。此飲片購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，水煎并濃縮成42 g／100 mL的溶液，4℃保存?zhèn)溆?；根?jù)臨床成人用量25 g／d，將尿毒清顆粒［康臣藥業(yè)（內(nèi)蒙古）有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號(hào)：20140913］配成25 g／100mL的溶液，4℃保存?zhèn)溆?；青霉素（華北制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：141219，規(guī)格為80萬(wàn)U／支）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑肌酐檢測(cè)試劑盒（C011-1，南京建成生物工程研究所）；尿素氮檢測(cè)試劑盒（C013-2，南京建成生物工程研究所）；BMP-7免疫組化試劑盒（BS-2242R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；MMP-2免疫組化試劑盒（BS04605R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；TIMP-2免疫組化試劑盒（BS-0416R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；二抗（SP-9001，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB顯色試劑盒（ZLI-9032，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；超純RNA提取試劑（D9108B，日本TaKaRa公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRRO47A，日本TaKaRa公司）；Real-time PCR試劑盒（DRR420A，日本TaKaRa公司）；5x RNA Loading Buffer（DRR420A，日本TaKaRa公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀（XT-2000iV，希森美康醫(yī)用電子有限公司）；石蠟切片機(jī)（RM2015，德國(guó)萊卡公司）；微量高速離心機(jī)（TG16W，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）；顯微鏡（BX51T-PHD-J11，日本奧林巴斯公司）；低溫冰箱（MDF-382E，日本三洋公司）；移液器（EPPENDORF，德國(guó)艾本德股份公司）；洗板機(jī)（AC8，芬蘭Thermo Labsystems公司）；分光光度計(jì)（NANODROP 2000，美國(guó)Thermo Scientific公司）；熒光定量PCR儀（ABI7500，美國(guó)Applied Biosystems公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（Image-Pro Plus，美國(guó)Media Cybernetics公司）。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模大鼠購(gòu)回飼養(yǎng)l周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組、對(duì)照組和治療組，每組各12只?？瞻捉M不予手術(shù)，假手術(shù)組僅做雙腎包膜剝離，其余3組均行5／6腎切除手術(shù)。具體步驟如下：參照文獻(xiàn)［1］，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，之后將其固定在鼠臺(tái)上，在左腎部剪毛，常規(guī)消毒，戴手套，鋪洞巾；在左腎部斜切2 cm，剪開皮膚、肌肉，將左腎從腹側(cè)往切口托出，至充分暴露為止，剝離腎包膜，用止血鉗鉗住左腎腎蒂，以便暫時(shí)阻斷左腎的血供，盡量切除2／3腎組織的上、下兩極，然后用明膠海綿壓迫止血，直至無(wú)明顯出血，取下止血鉗，復(fù)位殘余腎臟，縫合各層組織；術(shù)后切口強(qiáng)力碘消毒，并在腹腔內(nèi)連續(xù)3 d注射量為

7.2萬(wàn)U／100 g的青霉素；1周后進(jìn)行第2次手術(shù)，在右腎部位做斜切口（而后步驟同上），結(jié)扎腎門，切除右腎（而后步驟同上）。

2.2 模型鑒定造模完4周后均以尾靜脈采血用于比較各組大鼠的腎功能。結(jié)果顯示：模型組、對(duì)照組和治療組的血肌酐、尿素氮均明顯高于空白組，表明造模成功。

2.3 給藥干預(yù)造模完4周后每天上午給藥，劑量均按臨床成人每公斤體重用量的6倍換算。治療組予灌42%的桃核承氣湯溶液10 mL／（kg·d－1）；對(duì)照組予灌25%的尿毒清溶液10 mL／（kg·d－1）；其余3組分別給予灌等量生理鹽水。給藥時(shí)間為8周。

2.4 采集標(biāo)本

2.4.1 檢測(cè)血常規(guī)和腎功能給藥后第57天將大鼠在腹腔麻醉下，腹主動(dòng)脈采血6～8 mL。1號(hào)管：取2 m L血樣，置于預(yù)先加好2%EDTANa2的試管中，搖勻后置于4℃、3 000轉(zhuǎn)／min的離心機(jī)中離心10 min，吸取上層血漿，保存于-20℃冰箱中，用于測(cè)定血常規(guī)；2號(hào)管：取4mL血樣置于不加任何抗凝劑的試管中靜置，然后在4℃、3 000轉(zhuǎn)／min的離心機(jī)中離心10min，吸取上層血清，置于-20℃冰箱中保存，用于測(cè)定腎功能。

2.4.2 腎組織取樣采血后處死大鼠，取兩塊腎組織，分別放入4%多聚甲醛和RNA保存液中固定。前者備做蛋白檢測(cè)和光鏡觀察，后者備做基因檢測(cè)。

2.5 大鼠一般情況造模前各組大鼠體型豐滿，反應(yīng)靈敏，被毛密集，毛色光亮，飲食、二便均正常，體重未見明顯變化。造模后模型組、對(duì)照組和治療組大鼠體型瘦小，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)量減少，皮毛蓬松，毛色枯槁，飲食及二便均減少，體重明顯下降。大鼠死亡情況：空白組在實(shí)驗(yàn)的第5周死亡3只；假手術(shù)組分別在第1次和第2次的腎包膜剝離術(shù)后1周內(nèi)各死亡1只，術(shù)后第5周死亡1只；模型組分別在第1次和第2次造模后1周內(nèi)各死亡2只；對(duì)照組在第1次造模后1周內(nèi)死亡3只，在第2次造模后1周內(nèi)死亡1只，造模后第5周死亡1只；治療組在第1次造模后1周內(nèi)死亡1只，在第2次造模后1周內(nèi)死亡2只，在造模后的第5周死亡1只。

2.6 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)血常規(guī)檢測(cè)采用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀；血Scr檢測(cè)采用除蛋白苦味酸比色法；BUN檢測(cè)采用脲酶法；腎組織BMP-7、MMP-2及TIMP-2蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化法；腎組織BMP-7、MMP-2及TIMP-2 mRNA表達(dá)檢測(cè)采用Real-Time PCR法；光鏡采用HE染色法觀察。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析；用Testof Homogeneity of Variance檢驗(yàn)方差齊性，若方差齊則用LSD檢驗(yàn)，若方差不齊則用Games-Howell檢驗(yàn)。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組RBC、HB比較見表1。

表1 各組RBC、Hb比較（±s）

表1 各組RBC、Hb比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對(duì)照組比較，3）P＜0.05。

組別空白組假手術(shù)組模型組對(duì)照組治療組Hb／（g／L）161.58±1.88 161.81±2.38 105.54±4.621）127.92±3.852）128.66±2.443）n99878 RBC／（×1012／L）9.13±0.23 9.06±0.27 6.06±0.151）6.95±0.082）7.04±0.093）

3.2 各組血Scr、BUN比較見表2。

表2 各組血Scr、BUN比較（s）

表2 各組血Scr、BUN比較（s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對(duì)照組比較，3）P＜0.05。

BUN／（mmol／L）6.27±0.95 6.39±0.61 25.86±2.941）16.75±2.632）12.09±1.283）組別空白組假手術(shù)組模型組對(duì)照組治療組n99878血Scr／（μmol／L）69.84±6.89 68.35±7.51 177.06±7.031）133.74±10.052）96.78±8.083）

3.3 各組BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果比較見表3。

表3 各組BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果比較（±s）

表3 各組BMP-7、MMP-2、TIMP-2蛋白表達(dá)結(jié)果比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對(duì)照組比較，3）P＜0.05。

?

3.4 各組BMP-7、MMP-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表4。

3.5 病理觀察光鏡下顯示：空白組與假手術(shù)組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均清晰可見，腎小球和腎小管均未

見萎縮性病變，腎間質(zhì)也未見纖維增生；模型組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)大都消失，細(xì)胞排列分布參差不齊，多數(shù)腎小球皺縮、變硬，腎間質(zhì)多呈大片狀纖維化，腎小管萎縮或擴(kuò)張，甚或消失；對(duì)照組腎組織有部分結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞排列分布較紊亂，腎小球少許皺縮、變形，腎間質(zhì)纖維組織少量增生，可見部分腎小管擴(kuò)張；治療組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常，細(xì)胞排列分布尚整齊，腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常，腎間質(zhì)多無(wú)纖維增生，腎小管未見明顯病變。見圖1。

表4 各組BMP-7、MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組BMP-7、MMP-2mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與對(duì)照組比較，3）P＜0.05。

4討論

近年來(lái)許多醫(yī)家認(rèn)為CRF主要病機(jī)是邪毒深入營(yíng)血，化熱成毒，而致腎絡(luò)瘀阻［2］。研究發(fā)現(xiàn)：毒邪與瘀血貫穿CRF的始終，二者互相轉(zhuǎn)化，可膠結(jié)成瘀毒［3］。還有學(xué)者提出要從瘀論治CRF［4］。張喜奎教授［5］認(rèn)為CRF病在厥陰形成的下焦瘀水互結(jié)證，與《傷寒論》所述的蓄血證類似。趙紹琴教授［6］認(rèn)為CRF基本病機(jī)為濕熱深入營(yíng)血，日久形成瘀毒。馬進(jìn)教授［7］亦認(rèn)為瘀血內(nèi)阻、日久成積是CRF的主要病機(jī)。桃核承氣湯化瘀解毒、通腑瀉濁，契合CRF主要病機(jī)特點(diǎn)，方中桃仁能破血行瘀，去宛陳莝，使CRF瘀阻的腎絡(luò)暢通，從而改善腎功能。如李小波等［8］通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明：桃仁有一定的抗腎間質(zhì)纖維化和保護(hù)腎小管功能作用；大黃通腑瀉濁，與桃仁共為君藥，現(xiàn)代研究［9］表明：大黃可促進(jìn)有毒代謝產(chǎn)物的排出；芒硝能瀉熱軟堅(jiān)，桂枝能溫陽(yáng)通脈，既可助桃仁祛瘀解毒，又可制約大黃及芒硝寒涼之弊，與芒硝共為佐藥；炙甘草補(bǔ)中益氣，調(diào)和諸藥。

CRF的進(jìn)展過(guò)程主要包括腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化等。若一旦形成腎間質(zhì)纖維化就預(yù)示著進(jìn)展至CRF的必然性，其輕重程度更能反映腎臟病的病情演變及預(yù)后［10］。而腎間質(zhì)纖維化多與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度蓄積于正常腎組織有關(guān)，其形成的主要機(jī)制是ECM合成過(guò)度及降解受到抑制。ECM降解涉及多種蛋白酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和其特定的組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是比較重要的酶類［11］。MMP-2對(duì)ECM起特異降解作用，TIMP-2對(duì)MMP-2起抑制作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）能保護(hù)腎功能，其活性升高能減輕腎間質(zhì)纖維化。研究發(fā)現(xiàn)：BMP-7可提高M(jìn)MP-2的表達(dá)，使ECM積聚減少，從而減輕腎間質(zhì)纖維化［12］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已證實(shí)：在CRF進(jìn)程中始終存在高凝狀態(tài)，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)率（GFR）下降等，相當(dāng)于中醫(yī)之“濁毒瘀血”。桃核承氣湯立法處方與CRF病機(jī)相符，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：桃核承氣湯能顯著升高RBC計(jì)數(shù)及Hb含量，顯著降低血Scr和BUN水平，提高BMP-7、MMP-2蛋白及mRNA的表達(dá)而抑制TIMP-2蛋白的表達(dá)，并能在病理上減輕腎間質(zhì)纖維化程度。

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R285.5

A

1000-338X（2016）04-0037-03

2016－05－15

2013年度福建省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（wzsb201302）

莊秀輝（1988—），男，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：中醫(yī)腎病研究。

張喜奎（1963—），男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。E-mail：zhxk1963@aliyun.com