E6/E7 HPV mRNA檢測在Ⅱ級及以上宮頸上皮內瘤變診斷中的應用

宋曉婕，陳峪，曾友玲，周燕，向赟，張妍

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430000)

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E6/E7 HPV mRNA檢測在Ⅱ級及以上宮頸上皮內瘤變診斷中的應用

宋曉婕，陳峪，曾友玲，周燕，向赟，張妍

(武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心，武漢 430000)

目的 觀察E6/E7 HPV mRNA檢測在Ⅱ級及以上宮頸上皮內瘤變(CIN)診斷中的應用效果。方法 因慢性宮頸炎、不明原因陰道出血、宮頸贅生物、長期分泌物異常等可疑宮頸病變就診的865例患者,行宮頸脫落細胞HPV DNA、E6/E7 HPV mRNA檢測,以陰道鏡下宮頸活檢作為金標準，比較兩種檢測方法診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。結果 E6/E7 HPV mRNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為87.79%，特異度為59.11%，陽性預測值為58.64%，陰性預測值為88.00%；HPV DNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為92.17%，特異度為22.01%，陽性預測值為44.04%，陰性預測值為81.43%；兩者特異度、陽性預測值比較，P均<0.05。結論 E6/E7 HPV mRNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN特異度高。

人乳頭瘤病毒;人乳頭瘤病毒DNA;E6/E7人乳頭瘤病毒mRNA；宮頸上皮內瘤變

人乳頭瘤病毒(HPV)是女性生殖系統(tǒng)比較常見的性傳播病毒[1]。已經證實，高危HPV的感染和宮頸上皮內瘤變(CIN)、宮頸癌的進展密切相關[2]。HPV感染雖常見，但大部分為一過性，約90%的幾率會在2年之內清除[3，4]，并且僅長時間的持續(xù)感染才與CIN的形成和進展相關[4]。HPV感染在女性一生中的風險約為80%，僅3%～5%的人存在長期持續(xù)感染，并進展成宮頸癌[3,5]。篩查人群數據顯示，HPV DNA感染率在年輕女性中較高，為25%～65%，35歲以上穩(wěn)步下降為10%～30%[5～7]。歐洲生殖道感染和腫瘤研究組織(EUROGIN)自2007年開始推薦30歲以上女性將HPV DNA作為宮頸癌篩查首選手段[8]，我國的“兩癌篩查”項目自2015年也逐漸開始進行HPV DNA試點篩查工作。盡管HPV感染大部分為一過性，但目前無法判斷感染是否致癌，因此給患者帶來了心理負擔；此外，現(xiàn)有指南基于衛(wèi)生經濟學、HPV DNA特異性等原因，僅推薦30歲以上人群進行篩查，但有報道[9]顯示，小于30歲的女性仍存在35%的Ⅱ級及以上CIN漏診情況，因此尋找HPV更加特異性的致癌指標一直是近年來的研究熱點。HPV E6/E7病毒基因的過量表達被認為與細胞轉化有關，E6、E7可與宿主基因整合，影響細胞調控因子如p53和prb的功能,導致細胞分化異常，細胞形態(tài)產生持續(xù)改變最終進展成CIN[10～12]。因此，檢測HPV致癌基因可能有助于更準確地篩查宮頸高度病變和宮頸癌高風險人群[13，14]。本研究以宮頸病理檢查結果為金標準，觀察了E6/E7 HPV mRNA檢測在Ⅱ級及以上CIN診斷中的應用效果，并與HPV DNA檢測進行比較?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年6月～2015年6月在武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心婦科門診因慢性宮頸炎、不明原因陰道出血、宮頸贅生物、長期分泌物異常等可疑宮頸病變就診的865例女性患者,受試者年齡20～65歲、平均42.5歲，≥30歲420例、<30歲445例，近5年未行宮頸治療(物理或手術治療)、宮頸活檢、放化療。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集和處理 以擴陰器暴露宮頸口，用棉拭子將宮頸過多的分泌物擦去，將宮頸刷伸入宮頸口處，在宮頸鱗柱交界處順時針旋轉3～5圈,刷取宮頸脫落細胞后，將其放入裝有細胞保存液的樣本管中，避光放置，待用于E6/E7 HPV mRNA和HPV DNA檢測。

1.2.2 E6/E7 HPV mRNA檢測 取1 mL細胞保存液，3 000 r/min離心，去上清液，用2 mL蒸餾水清洗后再次離心去上清，加入裂解劑(Diacarta公司提供，由lysis mixture和proteinase K按1∶800混合)，65 ℃溫浴30 min，裂解過程中可震蕩2、3次，取上清，加入終止液終止反應。將標本溶液加入孔板，經過雜交捕獲mRNA、信號放大、底物發(fā)光法反應后，用QuantiVirusTM冷光儀進行檢測，數據經配套軟件分析后直接讀取結果(試劑盒和檢測儀器均由河南中美合資科蒂亞生物技術有限公司提供)。

1.2.3 HPV DNA檢測 取剩余的細胞保存液，加入離心管，14 000 r/min離心，去上清，裂解標本(裂解液由廣東凱普提供)，進行PCR擴增(ABI VeritiPCR擴增儀)后，使用HybriMax快速核酸分子雜交儀(廣東凱普)雜交顯色和信息讀取，可區(qū)分35種不同型別HPV(包括20種高危HPV及15種低危HPV)。將不同型別高危HPV統(tǒng)一做為陽性結果。

1.2.4 宮頸組織病理檢查 所有受試者均行陰道鏡下宮頸活檢。取宮頸可疑病變組織或常規(guī)3、6、9、12點組織于甲醛液中固定，專業(yè)病理醫(yī)師進行病檢結果分析，對于宮頸活檢結果高度病變(Ⅱ級及以上CIN)者行宮頸錐切以確定最終病理診斷結果。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。以陰道鏡下宮頸活檢作為金標準，計算并比較兩種檢測方法診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值，比較方法采用χ2檢驗和確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

865例女性病理診斷陰性390例、CIN Ⅰ級131例、CIN Ⅱ級157例、CIN Ⅲ級119例、宮頸浸潤癌(ICC)68例。隨著宮頸病變級別的增加，HPV DNA、E6/E7 HPV mRNA檢測陽性率隨之上升(P均<0.05，表1)。HPV DNA檢測143例陰性中E6/E7 HPV mRNA檢測陰性121例、陽性22例，HPV DNA檢測722例陽性中E6/E7 HPV mRNA檢測陰性229例、陽性493例，兩種檢測方法的一致性為70.98%(614/865)。E6/E7 HPV mRNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為87.79%，特異度為59.11%，陽性預測值為58.64%，陰性預測值為88.00%；HPV DNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為92.17%，特異度為22.01%，陽性預測值為44.04%，陰性預測值為81.43%；兩者特異度、陽性預測值比較，P均<0.05。在<30歲患者中，E6/E7 HPV mRNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為94.10%，特異度為62.80%，陽性預測值為57.20%，陰性預測值為95.30%，漏診率為5.90%；HPV DNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為91.50%，特異度為20.20%，陽性預測值為35.00%，陰性預測值為81.90%，漏診率為8.50%；兩者敏感度、特異度、陽性預測值比較，P均<0.05。在≥30歲患者中，E6/E7 HPV mRNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為82.60%，特異度為54.30%，陽性預測值為59.90%，陰性預測值為79.10%，漏診率為17.40%；HPV DNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的敏感度為93.20%，特異度為25.20%，陽性預測值為50.70%，陰性預測值為81.70%，漏診率為6.80%；兩者敏感度、特異度、陽性預測值比較，P均<0.05。

表1 E6/E7 HPV mRNA、HPV DNA、病理診斷檢查結果(例)

3 討論

目前，宮頸癌作為女性生殖器官的惡性腫瘤已嚴重威脅全球女性的生殖健康，在我國其發(fā)病率僅次于乳腺癌。在全球范圍內，宮頸癌治療已取得了很好的效果，但仍缺少能早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌的檢測指標。在我國大部分地區(qū)，宮頸癌篩查的第一步主要是宮頸刷片細胞學檢查或HPV DNA檢測，異常時通常根據指南進行重復細胞學檢查(HPV DNA檢測或陰道鏡活檢等)，但細胞學敏感度較低，HPV DNA特異度較低。HPV感染人群的比例在不同地區(qū)和人群中各不相同,大多認為在有性生活的女性中感染率在30%左右[15],在小于30歲的性活躍期女性中的比例更高。盡管大部分HPV感染在2年內會自行清除，但DNA檢測無法預測短暫的一過性感染，隨后的分流處理如進行陰道鏡和侵入式活檢等，會帶來過度診斷和過度醫(yī)療的風險，也增加了患者的經濟負擔和心理負擔。有研究[16]表明，RNA的陽性率在所有級別宮頸病變中較DNA低，尤其是在活檢陰性的女性，HPV DNA陽性的患者mRNA陰性，反映并不是所有HPV感染都會表達E6和E7，而這些感染預計是一過性感染。

本研究的865例女性在就診時均伴有不同程度的臨床表現(xiàn)，這并不是一個常規(guī)篩查人群。檢測的病檢結果中，有許多陽性案例，包括宮頸低級別病變、高級別病變甚至浸潤癌，HPV DNA和mRNA兩種分子學檢測被用來評估其在Ⅱ級及以上CIN的臨床價值。兩種檢測手段結果陽性率均隨著宮頸病變程度增高而升高，但HPV mRNA檢測結果陽性率更低，特別在陰性人群和CIN Ⅰ級的樣本中，這與之前的研究[13]結論是一致的。這也是由分子學的特性決定的，HPV DNA檢測能辨別是否存在感染，這種感染可能是一過性或沒有臨床意義的，但E6/E7 HPV mRNA檢測結果陽性反映患者可能存在HPV持續(xù)感染并導致病變進展[17]。已有研究[18]顯示，與HPV DNA相比，mRNA有更顯著的陽性預測值和特異度。另外，一項隨訪研究也顯示，HPV E6/E7 mRNA較HPV DNA在細胞學不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞和低度鱗狀上皮內病變結果的女性特異度高[19]。同時，在一項愛爾蘭的研究[20]中證實，mRNA的敏感度好。盡管HPV感染在30歲以前是高峰，并隨后穩(wěn)步下降，甚至小于25歲的女性1年之內可能會清除病毒[3,21],HPV DNA目前也僅做為30歲以上女性的推薦,但小于30歲的女性，仍存在35%的Ⅱ級及以上CIN漏診情況[9]。本研究結果從總體人群來看，E6/E7 HPV mRNA與HPV DNA有相似的敏感度，但特異度顯著高于HPV DNA，這與之前的結論類似，但既往研究較少將年齡作為一個因素進行分析。本研究結果顯示,在小于30歲人群中,HPV mRNA檢測的特異度更為顯著，高于DNA 2.5倍之多，Ⅱ級及以上CIN漏診率也小于HPV DNA檢測。

可見，E6/E7 HPV mRNA檢測診斷Ⅱ級及以上CIN的特異度高。

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