莪術(shù)醇與奧沙利鉑聯(lián)合腫瘤內(nèi)注射對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)、瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

王冬，李勇，郭志朋，趙群，范立僑，檀碧波，崔平

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011；2河北省人民醫(yī)院)

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莪術(shù)醇與奧沙利鉑聯(lián)合腫瘤內(nèi)注射對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)、瘤細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

王冬1，李勇1，郭志朋1，趙群1，范立僑1，檀碧波1，崔平2

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011；2河北省人民醫(yī)院)

目的 觀察莪術(shù)醇與奧沙利鉑聯(lián)合腫瘤內(nèi)注射對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)、瘤細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制。方法 20只裸鼠，建立胃癌移植瘤模型，將其隨機(jī)分為對(duì)照組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組、聯(lián)合組各5只，對(duì)照組腫瘤內(nèi)注射生理鹽水(0.05 mL/10 g)，莪術(shù)醇組腫瘤內(nèi)注射莪術(shù)醇(100 mg/kg)，奧沙利鉑組腫瘤內(nèi)注射奧沙利鉑(30 mg/kg)，聯(lián)合組腫瘤內(nèi)注射莪術(shù)醇(100 mg/kg)與奧沙利鉑(30 mg/kg)，每4 d 1次，共4次。觀察各組腫瘤生長(zhǎng)情況，MTT法測(cè)算各組腫瘤組織中的瘤細(xì)胞存活率，熒光定量PCR檢測(cè)各組腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3 mRNA，免疫組化法檢測(cè)各組腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3蛋白。結(jié)果 與對(duì)照組相比，聯(lián)合組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組腫瘤體積小、重量低、瘤細(xì)胞存活率低、Caspase-3表達(dá)高、Bcl-2表達(dá)低，且聯(lián)合組變化更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 莪術(shù)醇聯(lián)合奧沙利鉑腫瘤內(nèi)注射可抑制裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)并抑制瘤細(xì)胞增殖，這可能與上調(diào)Caspase-3、下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

莪術(shù)醇；奧沙利鉑；胃癌；裸鼠移植瘤模型；B淋巴細(xì)胞瘤2；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶

研究[1]發(fā)現(xiàn)，中藥及其提純物聯(lián)合化療藥物治療胃癌術(shù)后，在提高患者生存質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期、提高免疫功能、減輕化療毒副作用等方面均優(yōu)于單純化療。莪術(shù)醇是中藥莪術(shù)的主要有效成分，對(duì)于結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、骨肉瘤等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[2～5]。莪術(shù)醇可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，還可以通過調(diào)控一些信號(hào)通路的表達(dá)及活性而對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。但這些結(jié)果大多是由體外研究得來，有關(guān)莪術(shù)醇抗腫瘤的體內(nèi)研究少見。本研究觀察了莪術(shù)醇與奧沙利鉑聯(lián)合腫瘤內(nèi)注射對(duì)裸鼠胃癌移植瘤生長(zhǎng)、瘤細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 22只4～5周齡、雄性BALB/c裸鼠，體質(zhì)量17.5～23.5 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級(jí)飼養(yǎng)。莪術(shù)醇純品購自中國食品藥品檢定研究院(純度>99%)；Bcl-2、Caspase-3基因引物由上海生工生物公司合成，抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌細(xì)胞株BGC-823(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心)細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、相對(duì)濕度為95%培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640。細(xì)胞2～3 d換液1次，常規(guī)傳代。

1.3 裸鼠胃癌移植瘤模型制備 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞(3.0×106/mL)0.2 mL注射于2只裸鼠腋部皮下。在瘤體直徑約1.0 cm時(shí)，處死裸鼠，剝離瘤體，剪成約1 mm3的瘤塊種植于20只裸鼠的腋部皮下，當(dāng)瘤體直徑約1.0 cm時(shí)開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 莪術(shù)醇、奧沙利鉑用法 將20只荷瘤裸鼠模型隨機(jī)分為對(duì)照組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組、聯(lián)合組各5只，對(duì)照組腫瘤內(nèi)注射生理鹽水(0.05 mL/10 g)，莪術(shù)醇組腫瘤內(nèi)注射莪術(shù)醇(100 mg/kg)，奧沙利鉑組腫瘤內(nèi)注射奧沙利鉑(30 mg/kg)，聯(lián)合組腫瘤內(nèi)注射莪術(shù)醇(100 mg/kg)與奧沙利鉑(30 mg/kg)，每4 d 1次，共4次。計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積=1/2×a×b2(a、b分別代表移植瘤最長(zhǎng)徑和最短徑，單位mm)。第17天處死裸鼠，剝離瘤體、稱量瘤重(g)，計(jì)算抑制率。抑制率=(對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重)/對(duì)照組瘤重×100%。

1.5 瘤細(xì)胞增殖檢測(cè) 采用MTT法。將剛離體的瘤體制成單細(xì)胞懸液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的瘤細(xì)胞懸液(3.1×104/mL)，接種于96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL含10%小牛血清的培養(yǎng)液。在CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μL的DMSO，震蕩10 min。測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm的光密度(OD)值。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.6 腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3 mRNA檢測(cè) 采用熒光定量PCR法。取-80 ℃保存的腫瘤組織約200 mg，TRIzol提取RNA，檢測(cè)RNA完整性和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為cDNA 2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DEPC水7 μL，SYBR Green Supermix 10 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為95 ℃預(yù)變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸30 s。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入結(jié)果分析界面，以GAPDH為內(nèi)參照基因，按照2-ΔΔCt相對(duì)定量公式，計(jì)算出各組目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3蛋白檢測(cè) 將甲醛固定的瘤組織制成蠟塊，切片，進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色(S-P法)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。光鏡下(400×)隨機(jī)觀察5個(gè)視野，采取二次計(jì)分法，首先按染色強(qiáng)度計(jì)分，無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分；再按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分，陰性計(jì)0分，陽性細(xì)胞≤10%計(jì)1分，>10%～50%計(jì)2分，>50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。將染色強(qiáng)度得分和細(xì)胞數(shù)得分的乘積判斷表達(dá)結(jié)果，0<積分≤2為弱表達(dá)，>2為強(qiáng)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 各組裸鼠腫瘤體積、重量比較 聯(lián)合組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組、對(duì)照組第17天腫瘤體積分別為(1 087.00±120.95)、(1 674.77±170.85)、(1 322.20±135.10)、(2 081.64±193.69)mm3，腫瘤重量分別為(0.96±0.11)、(1.48±0.10)、(1.36±0.17)、(2.02±0.23)g，聯(lián)合組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組與對(duì)照組相比，聯(lián)合組與莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組相比，P均<0.05。聯(lián)合組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組、對(duì)照組腫瘤抑制率分別為51.8%±6.3%、26.0%±12.3%、31.9%±11.3%、100.0%。

2.2 各組裸鼠腫瘤組織瘤細(xì)胞存活率比較 結(jié)果見表1。

2.3 各組裸鼠腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3 mRNA比較 見表2。

2.4 各組裸鼠腫瘤組織Bcl-2、Caspase-3蛋白比較 聯(lián)合組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組、對(duì)照組Caspase-3強(qiáng)表達(dá)陽性率分別為93.33%、66.67%、86.67%、26.67%，Bcl-2強(qiáng)表達(dá)陽性率分別為13.33%、23.33%、25.00%、86.67%，聯(lián)合組、莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組與對(duì)照組相比，聯(lián)合組與莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組相比，P均<0.05。

表1 不同培養(yǎng)時(shí)間各組裸鼠腫瘤組織瘤細(xì)胞存活率比較

注：與對(duì)照組相比,*P<0.05；與莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組相比,#P<0.05。

表2 各組裸鼠腫瘤組織Bcl-2、Caspass-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較±s)

注：與對(duì)照組相比,*P<0.05；與莪術(shù)醇組、奧沙利鉑組相比,#P<0.05。

3 討論

胃癌的治療是綜合治療[6]。化療在胃癌的治療中占有重要的地位，但可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞藥物抵抗的形成，最終導(dǎo)致化療失敗。奧沙利鉑是用于胃癌化療的一線藥物，同樣存在上述問題，故聯(lián)合新藥物治療改善奧沙利鉑的治療效果有重要意義。近年來，中藥及其提取物已成為研究的重點(diǎn)。中藥抗腫瘤具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)，并且毒副作用較小，能提高患者免疫力，不易產(chǎn)生耐藥性[7]。莪術(shù)醇為近年受關(guān)注的藥物之一。

莪術(shù)是姜科姜黃屬的草本植物，在中醫(yī)治療中應(yīng)用較為廣泛。該藥具有行氣破瘀、止痛等療效，多用于胃脹氣滯、腹痛等癥候的治療。中醫(yī)認(rèn)為患者情志不舒、飲食不調(diào)、痰凝氣滯、熱毒血瘀交阻于胃而導(dǎo)致胃癌發(fā)生。莪術(shù)用于胃癌治療有其中醫(yī)理論依據(jù)。莪術(shù)醇是莪術(shù)的提取物，也是其主要有效成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。對(duì)胃癌細(xì)胞的體外研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[4,8]。本研究應(yīng)用人胃癌細(xì)胞株皮下移植技術(shù)成功制備了裸鼠胃癌移植瘤模型，比較了不同處理方式對(duì)腫瘤的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，莪術(shù)醇、奧沙利鉑分別及聯(lián)合應(yīng)用鼠腫瘤體積減小、質(zhì)量降低，且聯(lián)合用藥作用最為明顯。這一結(jié)果說明莪術(shù)醇對(duì)胃癌有治療作用，莪術(shù)醇與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。為從細(xì)胞學(xué)角度觀察莪術(shù)醇、奧沙利鉑的作用，本研究應(yīng)用MTT法檢測(cè)了各組瘤細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示，莪術(shù)醇單獨(dú)應(yīng)用即有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，并可降低瘤細(xì)胞活性，與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用后抑制腫瘤細(xì)胞活性的作用更為明顯。提示莪術(shù)醇在胃癌治療中可能有較好的應(yīng)用前景。為了解莪術(shù)醇抑制胃癌的生長(zhǎng)的分子機(jī)制，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組腫瘤組織中的Bcl-2和Caspase-3。Bcl-2和Caspase-3是反映胃癌細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[9,10]。胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，這是胃癌鉑類藥物治療不理想的重要原因。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，聯(lián)合組、奧沙利鉑組、莪術(shù)醇組Caspase-3表達(dá)升高且Bcl-2表達(dá)下降。說明莪術(shù)醇對(duì)胃癌的治療效果可能與其上調(diào)Caspase-3、下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。但莪術(shù)醇與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用的實(shí)際效果及最適用藥方案還有待大規(guī)模的臨床研究。

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Effects of curcumol combined with oxaliplatin on xenograft growth and proliferation of gastric cancer tumor cells in nude mice

WANGDong1,LIYong,GUOZhipeng,ZHAOQun,FANLiqiao,TANBibo,CUIPing

(1TheFourthAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China)

Objective To observe the effects of curcumol combined with oxaliplatin on xenograft growth of gastric cancer cells in nude mice, then to explore the mechanism.Methods Twenty nude mice were selected to establish the xenograft models of gastric cancer cells in nude mice. Nude-mice xenograft models were randomly divided into four groups (n=5 in each group): the control group, curcumol group, oxaliplatin group and curcumol combined with oxaliplatin group (combined treatment group), then they were respectively treated with normal saline (0.05 mL/10 g), curcumol (100 mg/kg), oxaliplatin (30 mg/kg) and curcumol (100 mg/kg) combined with oxaliplatin (30 mg/kg), once every 4 days for four times. The growth of tumor was recorded. The cell survival rate of tumor cells in cancer tissues was determined by MTT. The expression levels of Caspase-3, Bcl-2 mRNA and protein were detected by fluorescence quantitative RT-PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the control group, the tumor volume, weight, cell survival rate and the expression of Bcl-2 was decreased but the expression of Caspase-3 was increased in the curcumol group, oxaliplatin group and combined treatment group, and these changes were more significant in the combined treatment group (allP<0.05).Conclusion The curcumol combined with oxaliplatin may inhibit the xenograft growth and proliferation of gastric cancer tumor cells in nude mice, and the mechanism may be related to the up-regulation of Caspase-3 and down-regulation of Bcl-2.

curcumol; oxaliplatin; gastric carcinoma; xenograft models in nude mice; Bcl-2, Caspase-3

國家自然基金面上項(xiàng)目(81372580)；河北省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項(xiàng)目(2014145D)。

王冬(1974-)，男，博士，副教授，主要從事胃癌新藥物療法的研究。E-mail: wangdongcuiping@126.com

簡(jiǎn)介：李勇(1958-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事消化道惡性腫瘤基礎(chǔ)與臨床的研究。E-mail: li_yong_hbth@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.006

R735.2

A

1002-266X(2016)35-0021-03

2015-12-27)