星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選制巴戟天炮制工藝

史輯，黃玉秋，耿彤彤，范亞楠，賈天柱

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點(diǎn)研究室，遼寧 大連 116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選制巴戟天炮制工藝

史輯1，2，3，黃玉秋1，耿彤彤1，范亞楠1，賈天柱1，2，3

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局炮制原理解析重點(diǎn)研究室，遼寧 大連 116600；3.遼寧省中藥炮制工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116600

目的優(yōu)選制巴戟天的最佳炮制工藝。方法以巴戟肉為原料，通過單因素試驗(yàn)，選取加甘草汁量、煮制時(shí)間、悶潤(rùn)時(shí)間為自變量，以甲基異茜草素-1-甲醚、耐斯糖、水晶蘭苷、甘草苷、甘草酸含量的綜合評(píng)分為因變量，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選制巴戟天最佳炮制工藝。結(jié)果制巴戟天的最佳炮制工藝為：加甘草汁量1.5倍，悶潤(rùn)時(shí)間4 h，煮制時(shí)間25 min。實(shí)際測(cè)量值與OD預(yù)測(cè)值的偏差為1.39%。結(jié)論采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選的制巴戟天炮制工藝穩(wěn)定可行且預(yù)測(cè)性良好，可為制巴戟天的規(guī)范化生產(chǎn)提供依據(jù)。

制巴戟天；星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法；炮制工藝

巴戟天系茜草科巴戟屬多年生攀援木質(zhì)藤本植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，為著名的“四大南藥”之一，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕功效[1]，臨床用于治療陽痿遺精、宮冷不孕、月經(jīng)不調(diào)、少腹冷痛、風(fēng)濕痹痛、筋骨痿軟等癥。巴戟天主要含茜草素型蒽醌、環(huán)烯醚萜苷、寡糖等化學(xué)成分[2-3]。 2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載巴戟天的炮制品種有巴戟天、巴戟肉、鹽巴戟天和制巴戟天。本課題組前期研究結(jié)果表明，巴戟天炮制后化學(xué)成分發(fā)生較大改變，其中甘草制后茜草素型蒽醌含量增加最明顯，環(huán)烯醚萜苷和寡糖含量也有所增加；藥理實(shí)驗(yàn)表明甘草汁制巴戟天的脾腎雙補(bǔ)作用表現(xiàn)突出[4-5]。這與古文獻(xiàn)記載是一致的。我們通過臨床調(diào)研和飲片廠走訪發(fā)現(xiàn)，目前臨床廣泛使用的巴戟天炮制品種為鹽巴戟天，藥店或藥材集散地出售的制巴戟天也多為鹽巴戟天，而不是甘草汁制巴戟天。因此，制巴戟天的炮制工藝急需規(guī)范化，并明確其藥理作用及臨床應(yīng)用?；诖耍狙芯吭趩我蛩乜疾斓幕A(chǔ)上，以巴戟天中的活性成分甲基異茜草素-1-甲醚、水晶蘭苷、耐斯糖及甘草中的甘草苷和甘草酸含量為指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法全面優(yōu)化制巴戟天的炮制工藝參數(shù)，為制巴戟天的質(zhì)量控制、規(guī)范化生產(chǎn)以及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

LC-20A型高效液相色譜儀（SPD-M20A型檢測(cè)器，日本島津公司），E2695-2998型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），F(xiàn)A1004電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），AE240型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

巴戟天藥材購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根。甘草購(gòu)自大連海王星辰大藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根。水晶蘭苷對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-11062204，純度≥98.0%），耐斯糖對(duì)照品（日本W(wǎng)ako公司，批號(hào)292-64121，純度≥99.0%），甲基異茜草素-1-甲醚（本實(shí)驗(yàn)室自制，純度＞95%），食鹽（延吉高麗亞食品經(jīng)銷部），乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1樣品的制備

巴戟肉：巴戟天加1.0倍量水，50 ℃下悶潤(rùn)9 h，去除木心，切段10～15 mm。

制巴戟天：取甘草6 g，加水煎煮3次，每次1.5 h，合并煎煮液，濃縮至150 mL，即為甘草汁。取定量甘草汁，加入巴戟肉，悶潤(rùn)一定時(shí)間后，煎煮至甘草汁吸盡，即得。

2.2甲基異茜草素-1-甲醚含量測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取甲基異茜草素-1-甲醚對(duì)照品2.93 mg于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2色譜條件參照文獻(xiàn)[4，6]，選用Ecosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫（20∶80→42∶58，15 min；60∶40→95∶5，5 min），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。色譜圖見圖1。

圖1　制巴戟天中甲基異茜草素-1-甲醚HPLC圖

2.2.3供試品溶液的制備稱取不同炮制方法制備的制巴戟天粉末（過60目篩），精密稱定2 g，置于100 mL圓底燒瓶中，再加入氯仿80 mL，回流提取2次，每次2 h，合并濾液，回收氯仿，殘?jiān)约状级ㄈ葜?0 mL容量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3耐斯糖含量測(cè)定

2.3.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取128 mg耐斯糖，以甲醇-水（3∶97）定容至500 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.3.2色譜條件參照文獻(xiàn)[5，7]，選用Ecosil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（3∶97），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。色譜圖見圖2。

圖2　制巴戟天中耐斯糖HPLC圖

2.3.3供試品溶液的制備取不同炮制方法制備的制巴戟天粉末（過60目篩）0.5 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL乙酸乙酯，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，棄去濾液，揮干后，濾渣再加70%乙醇50 mL，離心，上清液旋干，用甲醇-水（3∶97）定容至25 mL量瓶中，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4水晶蘭苷含量測(cè)定

2.4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取15.8 mg水晶蘭苷對(duì)照品，用80%甲醇定容至50 mL容量瓶中，搖勻，即得。

2.4.2色譜條件參照文獻(xiàn)[5]，選用Venusil MP C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（5∶95→28.8∶71.2，15 min），檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。色譜圖見圖3。

圖3　制巴戟天中水晶蘭苷HPLC圖

2.4.3供試品溶液的制備取不同炮制方法制備的制巴戟天粉末（過60目篩）1 g，精密稱定，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入80%甲醇100 mL，冷浸1 h，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，過濾，回收甲醇，并用80%甲醇定容至10 mL容量瓶，取續(xù)濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.5甘草苷和甘草酸含量測(cè)定

2.5.1對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取甘草苷和甘草酸對(duì)照品6.8 mg和10.6 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.5.2色譜條件參照文獻(xiàn)[8]，選用Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水，梯度洗脫（0～8 min，19%乙腈；8～38 min，19%～50%乙腈；38～40 min，100%乙腈），流速為1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2.5.3供試品溶液的制備取樣品粉末3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.6單因素考察

2.6.1甘草汁的量取巴戟肉5份各30 g，分別加入0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5倍量的甘草汁，悶潤(rùn)5 h，蒸2 h后干燥。按上述方法測(cè)定各指標(biāo)性成分含量，計(jì)算綜合評(píng)分OD值，通過對(duì)甘草汁不同加入量進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出甘草汁為1.5倍量時(shí)最好。

2.6.2悶潤(rùn)時(shí)間取巴戟肉5份各30 g，加1.5倍量甘草汁，分別悶潤(rùn)0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 h，蒸2 h，按上述方法測(cè)定各指標(biāo)性成分含量，計(jì)算綜合評(píng)分OD值，通過對(duì)不同的悶潤(rùn)時(shí)間進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出悶潤(rùn)時(shí)間為4 h時(shí)最好。

2.6.3蒸制、煮制取巴戟肉5份各30 g，加1.5倍量甘草汁，分別蒸制0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h，其余5份分別煮制7、13、25、45、90 min，均悶潤(rùn)4 h并干燥，測(cè)定各指標(biāo)性成分含量，求出綜合評(píng)分OD值，對(duì)不同的蒸制和煮制時(shí)間進(jìn)行評(píng)價(jià)，可得出煮制方法更好，并且煮制25 min最好。

2.7星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化工藝

2.7.1星點(diǎn)設(shè)計(jì)依據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇加甘草汁的量（A，倍）、悶潤(rùn)時(shí)間（B，h）、煮制時(shí)間（C，min）為考察因素，每個(gè)因素選擇5個(gè)水平，用甲基異茜草素-1-甲醚含量、耐斯糖含量、水晶蘭苷含量、甘草苷和甘草酸含量的加權(quán)綜合評(píng)分OD值為指標(biāo)，優(yōu)選制巴戟天的炮制工藝。OD值＝0.3×耐斯糖含量＋0.3×甲基異茜草素-1-甲醚含量＋0.3×水晶蘭苷含量＋0.05×甘草酸含量＋0.05×甘草苷含量。因素水平和編碼見表1，試驗(yàn)安排和結(jié)果見表2。

表1　因素水平編碼

表2　試驗(yàn)安排和結(jié)果

2.7.2擬合模型以O(shè)D值為因變量，并依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert8.0.6.1軟件對(duì)各自變量進(jìn)行回歸分析，得回歸方程：Y＝-1.190 20＋0.976 1A＋0.422 7B＋0.035 9C－0.015 6AB＋0.003 194AC＋0.001 247BC－0.318 9A2－0.058 9B2－0.000 795 1C2（r＝0.967 8，P＝0.000 3）。相關(guān)系數(shù)r越大，模型的擬合度越高，預(yù)測(cè)性越好。由方差分析可見，A因素（加甘草汁量）及C因素（煮制時(shí)間）對(duì)OD值影響顯著（P＜0.05），見表3。

表3　方差分析結(jié)果

2.7.3效應(yīng)面的優(yōu)化和預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)根據(jù)回歸方程，應(yīng)用Design-Expert8.0.6.1軟件繪制影響較為顯著的2個(gè)因素和OD值的三維效應(yīng)面以確定最佳的工藝區(qū)域，篩選出最佳工藝，見圖4。

圖4　各因素對(duì)OD值影響的三維效應(yīng)面

在A和B因素中，隨著A（加甘草汁量）的增加曲面變得陡峭，B（悶潤(rùn)時(shí)間）則對(duì)曲面的影響較小，隨著B悶潤(rùn)時(shí)間的變化曲面較為平滑；在A和C因素中，隨A、C的增加，OD值也在不斷增加，直到達(dá)到最大值；B、C因素和A、C因素對(duì)OD值的影響比較相似。因此可以得出，B的影響較小而A、C的影響較為顯著。

2.7.4驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際并結(jié)合Design-Expert8.0.6.1軟件的計(jì)算，得出制巴戟天的最佳炮制工藝為：加甘草汁量1.5倍，悶潤(rùn)4 h，煮制25 min（每100 g巴戟肉用甘草6 g）。按照篩選出的最佳炮制工藝條件重復(fù)3次，得出平均實(shí)際測(cè)量值0.814 5，與理論預(yù)測(cè)值0.816之間的相對(duì)誤差[（預(yù)測(cè)值－實(shí)際值）÷預(yù)測(cè)值]＜5%，為1.39%。

3　討論

巴戟天經(jīng)甘草汁煮制后，脾腎雙補(bǔ)作用增強(qiáng)。本課題組前期研究表明，甘草汁制巴戟天有利于多糖成分的溶出，總蒽醌和游離蒽醌的含量均增加[9-10]，水晶蘭苷及寡糖的含量也有所增加[5-6]，故本課題選取耐斯糖、水晶蘭苷、甲基異茜草素-1-甲醚以及甘草中的甘草酸和甘草苷為指標(biāo)，對(duì)制巴戟天的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)化，以評(píng)價(jià)制巴戟天的飲片質(zhì)量，保證其藥效。本試驗(yàn)選擇星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，運(yùn)用非線性數(shù)學(xué)模型對(duì)此模型進(jìn)行擬合，對(duì)其工藝進(jìn)行優(yōu)化，可以直接看出最佳的效應(yīng)區(qū)域。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，所得出的最佳的工藝條件穩(wěn)定，精密度和重現(xiàn)性都較好。使用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)制巴戟天進(jìn)行工藝條件選擇比常用的正交設(shè)計(jì)更加直觀形象，方法是有效、可行的，具有實(shí)際應(yīng)用的價(jià)值。

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Optimization of Liqorice-Processing Technology of Morinda officinalis How by Central Composite Design-Reponse Surface Methodology

SHI Ji1,2,3, HUANG Yu-qiu1, GENG Tong-tong1,FAN Ya-nan1, JIA Tian-zhu1,2,3
(1. College of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China; 2.Key Laboratory of Processing Principle Analysis, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China; 3. Liaoning Research Center of Processing Engineering Technology for TCM, Dalian 116600, China)

Objective To optimize the licorice-processing technology of Morinda officinalis How. Methods Morinda officinalis How was selected as raw materials. Single-factor experiment was used to select licorice-juice amount, boiling time and moistening time as independent variables, the comprehensive scores of contents of rubiadin-1-methylether, nystose, monotropein, liquiritin, glycyrrhizinate as the dependent variables. The central composite design and response surface methodology was employed to optimize processing technology of Morinda officinalis How. Results The optimized processing parameters consisted of 1.5 times the amount of licorice juice, moistening 4 h, boiling 25 min. The deviation between real measured value and predicted value of OD was 1.39%. Conclusion The central composite design and response surface methodology for optimizing licorice-processing technology of Morinda officinalis How is stable, feasible and highly predictable, which can provide references for standardizing production of Morinda officinalis How.

Morinda officinalis How; central composite design and response surface methodology; processing technology

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.020

R283.3

A

1005-5304(2016)12-0081-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81473350）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81001635）

賈天柱，E-mail：jiatzh@126.com

（2015-12-03）

（2015-12-23；編輯：陳靜）