多葉棘豆體外抗菌作用部位的篩選研究

孟根小，奧·烏力吉，霍萬學，王秀蘭，王歡

1.中國農業(yè)大學農學與生命技術學院，北京 100193；2.內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028300

·實驗研究·

多葉棘豆體外抗菌作用部位的篩選研究

孟根小1，2，奧·烏力吉2，霍萬學2，王秀蘭2，王歡2

1.中國農業(yè)大學農學與生命技術學院，北京 100193；2.內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028300

目的對比研究多葉棘豆不同提取物對臨床常見6種致病菌體外抗菌作用，篩選抗菌活性部位，初步判斷藥效物質種類。方法以多葉棘豆不同溶劑（石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇）提取物為試驗藥物，采用微孔板二倍稀釋TTC法和瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度（MIC），液體轉染法測定最小殺菌濃度（MBC）。采用分光光度法測定總黃酮含量。結果多葉棘豆5種提取物均有體外抗菌作用，其中乙酸乙酯提取物抗菌作用最強，對最敏感菌（金黃色葡萄球菌）的MIC和MBC分別為0.02 mg/mL和1.25 mg/mL；其次為正丁醇提取物和石油醚提取物；剩余物的作用最弱。各提取物的總黃酮含量大小與抗菌活性強弱順序一致，即乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞二氯甲烷提取物＞剩余物。結論多葉棘豆體外抗菌作用與黃酮類成分密切相關。

多葉棘豆；提取物；體外抗菌；作用部位

多葉棘豆為豆科植物狐尾藻棘豆Oxytropis myriophylla（Pall.）DC.的干燥地上部分，蒙藥名為“那布其熱哈格·烏如吐扎”，是蒙醫(yī)常用殺“粘”藥物之一，具有殺粘、清熱、燥黃水、愈傷、生肌、合脈止血、消腫、軟便的功效[1-2]。多葉棘豆含有黃酮類[3-4]、木酚素類[5]、三萜皂苷[6]和生物堿類[7]等多種成分。因此，化學成分的探討成為該藥材的研究熱點。但關于殺“粘”作用，只有對白假絲酵母和大腸桿菌的抗菌研究[8-9]。為了進一步評價多葉棘豆的殺“粘”作用、篩選最佳活性部位，本實驗研究該藥不同提取物對臨床常見6種致病菌的體外抗菌作用，并基于筆者從該藥提取的化合物多為黃酮類[3]，測定各部位的總黃酮含量，初步判斷抑菌活性物質。

1　實驗材料

1.1藥物

多葉棘豆2014年7月采自內蒙古通遼市罕山自然保護區(qū)，經內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院布和巴特爾教授鑒定為豆科棘豆屬植物狐尾藻棘豆Oxytropis myriophylla（Pall.）DC.的干燥地上部分。

1.2菌種

金黃色葡糖球菌（CNCC38-C57-7）、變形桿菌（49023-2）、大腸埃希菌（44822-2）、銅綠假單胞菌（CV CC3359 Pa.1）、肺炎克雷伯菌（ATCC10031）和乙型副傷寒桿菌（50004），中國食品藥品檢定研究院，用MH肉湯稀釋為105、107CFU/mL菌液。

1.3主要試劑與儀器

蘆?。ú┟郎锟萍加邢薰?，批號Lc18211），苯扎溴銨溶液（山東利爾康科技股份有限公司），MH肉湯培養(yǎng)基（上海信裕生物科技有限公司），石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、二甲基亞砜、硝酸鋁、亞硝酸鈉和氫氧化鈉等試劑均為分析純。MJ-78高壓滅菌器（施都凱儀器設備有限責任公司），DK-600S水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司），生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），酶標儀（Multiscan MK3），DL-ZD1細菌比濁儀（珠海迪爾公司），CO2培養(yǎng)箱（FORMA STERI-CYCLE CO2Incubator），DHG-9076 A干烤箱（上海精宏實驗設備有限公司），UV-2501紫外-可見分光光度計（日本島津），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠），ISO9001電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2　實驗方法

2.1供試品溶液的制備

干燥多葉棘豆粉末（過100目篩）363 g加95%乙醇4 L回流提取3 h，過濾。藥渣再用95%乙醇2 L提取2次，過濾，合并濾液。濾液減壓回收乙醇得浸膏48 g。浸膏加適量水成懸浮液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取數次至無色，合并提取液，減壓回收提取溶劑，得石油醚提取物10.5 g、二氯甲烷提取物8.3 g、乙酸乙酯提取物2.7 g、正丁醇提取物10.9 g和提取剩余物15.6 g。分別精密稱取上述提取物0.2 g，依次加入10 mL二甲基亞砜完全溶解，配制5種提取物的供試液，濃度均為20.0 mg/mL。 100 ℃真空高壓滅菌20 min，備用。

2.2微孔板二倍稀釋TTC法測定最低抑菌濃度

經消毒的96孔培養(yǎng)板各孔中，用微量移液器加MH肉湯培養(yǎng)基100 μL。在每排第1孔中再加100 μL藥液，混合。吸取100 μL混合液移入第2孔，以此類推至第10孔后，棄去100 μL混合液。第11孔（陽性對照組）和第12孔（陰性對照組）中加0.30 μg/μL苯扎溴銨溶液和二甲基亞砜各100 μL，混合，棄去100 μL混合液。每孔加入105CFU/mL菌液100 μL和5 μL 0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液。微孔板置蕩器上震蕩1 min，蓋膠膜密封，放濕盤內35 ℃培養(yǎng)16～24 h，觀察。

采用目測法和酶標儀法判斷結果。前者，對比藥物組和陽性對照組的顏色，兩者顏色相同的最高稀釋度即為該藥最低抑菌濃度（MIC）。后者，于酶標儀波長450 nm處檢測樣品OD值。等于或接近陽性對照組OD值的最高稀釋度為MIC。如有高濃度有色樣品排除干擾，即連續(xù)3個試驗孔OD值順序遞增，且最高稀釋度孔（第3孔）OD值比陰性對照組OD值減少0.25以上時，以第2個孔的稀釋度為MIC。

2.3瓊脂平板稀釋法測定最低抑菌濃度

將5種多葉棘豆供試藥原液用無菌生理鹽水配制成1/2、1/4、1/8、1/16…1/256倍稀釋藥液，分別精密吸取倍稀釋藥液1 mL置于6 cm直徑無菌平皿，與9 mL MH瓊脂混合制備成含不同濃度藥液的平板，設2個復孔。待瓊脂平板凝固后，按照事先繪制的模板位置，在平皿底面對應區(qū)域做好菌名標記。用微量加樣器吸取1×107CFU/mL菌液2 μL，在每個對應位置將菌液涂布成直徑5～8 mmol/L的圓點。變形桿菌單獨接種在一個平皿上，其余5種菌接種于同一個平皿上。35 ℃培養(yǎng)16～20 h，觀察。完全抑制菌落生長的最低藥物濃度為該藥對供試菌的MIC。

2.4最小殺菌濃度的測定

采用液體轉染法。根據微孔板二倍稀釋TTC法測定結果，分別吸取MIC以上未見細菌生長的各微孔培養(yǎng)物0.1 mL，移種在不含藥物的MH瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃孵育24 h，仍無細菌生長的最高稀釋濃度為最小殺菌濃度（MBC）。

2.5分光光度法測定各提取物中的總黃酮含量

分別精密稱取多葉棘豆5種提取物0.1 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，稱重，超聲30 min，用70%乙醇補足缺失質量，過濾，取濾液得5種提取物溶液。精密吸取上述各溶液2 mL，分別加入50 mL容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1.5 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.5 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉20 mL，搖勻，放置20 min。以陰性對照液（不加樣品）為參比，用分光光度計510 nm波長處測定吸光度，計算樣品總黃酮含量。參照文獻[10-11]方法進行線性關系、精密度試驗、穩(wěn)定性試驗、重復性試驗和加樣回收試驗等方法學考察。

3　結果

3.1多葉棘豆不同溶劑提取物的最低抑菌濃度

多葉棘豆不同溶劑提取物對6種臨床致病菌均有抑菌效果，其中，對金黃色葡萄球菌抑菌作用最強，MIC為0.02 mg/mL，其次對大腸埃希菌和乙型傷寒桿菌的MIC均為1.25 mg/mL。綜合微孔板TTC法和瓊脂平板稀釋法檢測結果見表1、表2。雖然2種方法測得MIC有所差異，但是抑菌效果最好的均為乙酸乙酯提取物，其對6種致病菌的MIC范圍為0.02～2.50 mg/mL。正丁醇提取物和石油醚提取物抑制4種臨床致病菌，MIC范圍為0.31～2.50 mg/mL，二氯甲烷提取物抑制2種致病菌，剩余物只抑制金黃色葡萄球菌。

3.2多葉棘豆不同溶劑提取物的最小殺菌濃度

多葉棘豆不同溶劑提取物對6種臨床致病菌MBC結果見表3。除剩余物外，其他提取物對金黃色葡萄球菌和變形桿菌均有殺菌作用，MBC范圍為1.25～5.00 mg/mL和2.50～5.00 mg/mL。但在本實驗濃度下，不同溶劑提取物中只有乙酸乙酯提取物對6種致病菌均有殺菌效果，MBC范圍為1.25～5.00 mg/mL。正丁醇和石油醚提取物對4種致病菌有殺菌作用，MBC范圍為2.50～5.00 mg/mL。剩余物無殺菌作用。

表1　微孔板TTC法檢測多葉棘豆不同溶劑提取物MIC比較（mg/mL）

表2　瓊脂平板稀釋法檢測多葉棘豆不同溶劑提取物MIC比較（mg/mL）

表3　多葉棘豆不同溶劑提取物MBC比較（mg/mL）

3.3多葉棘豆不同溶劑提取物總黃酮含量比較

測定6個不同濃度的蘆丁標準溶液在510 nm波長處的吸光度，并以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標，計算回歸方程得Y＝0.109X－0.118，r2＝0.999 5，線性范圍7.982 1～64.105 7 μg/mL。方法學考察結果：精密度試驗、重復性試驗和穩(wěn)定性試驗所得樣品吸光度的RSD分別為1.23%、1.05%和1.72%；平均加樣回收率＝104.8%，RSD＝2.01%。

使用回歸方程計算多葉棘豆不同提取物的總黃酮含量見圖1。其中乙酸乙酯提取物總黃酮含量最高，為16.70%；其次為正丁醇提取物總黃酮含量為11.62%；剩余物總黃酮含量最低，為4.57%。

4　討論

根據“粘”為“肉眼看不到的致病蟲”的蒙醫(yī)理論[1]，人體各種致病微生物均屬于“粘”。作為蒙醫(yī)常用殺“粘”藥物之一，多葉棘豆對臨床常見6種致病菌均有體外抗菌作用。尤其對金黃色葡萄球菌作用最強，各提取物MIC和MBC范圍為0.02～5.00 mg/mL和1.25～5.00 mg/mL。然而不同提取物對各種致病菌的抑制作用有所差異。其中，乙酸乙酯提取物對6種致病菌均有殺菌作用，正丁醇和石油醚提取物殺菌4種；二氯甲烷提取物僅抑制金黃色葡萄球菌和變形桿菌，剩余物在本實驗濃度下無殺菌作用。因此，多葉棘豆抗菌活性物質的篩選部位首選乙酸乙酯提取物。由于多葉棘豆含有豐富的黃酮類物質，總黃酮含量測定結果表明，各提取物總黃酮含量大小與其抗菌活性強弱完全一致，即乙酸乙酯提取物＞正丁醇提取物＞石油醚提取物＞二氯甲烷提取物＞剩余物。進一步說明，多葉棘豆體外抗菌作用與黃酮類成分有關；乙酸乙酯提取物對6種致病菌較強的殺菌作用與其高含量的黃酮類成分密不可分。但是，多葉棘豆的化學成分多樣復雜，抗菌作用可能并非只取決于黃酮類成分，有待進一步深入研究。

本研究采用微孔板二倍稀釋法和瓊脂平板稀釋法測定MIC，2種方法互為驗證，意在獲得較為確切的實驗數據，2種實驗方法測得的MIC數據具有較好的一致性。但2種實驗方法中，相同藥物提取物對少數菌的作用出現(xiàn)不同的結果，其原因除了實驗條件的控制因素外，首先可能與不同的細菌在液體和固體2種培養(yǎng)基中生長活力不同有關，其次可能與藥物在2種培養(yǎng)基中保持和發(fā)揮活性的狀態(tài)不同有關。這種現(xiàn)象在本實驗MBC測定中同樣有所表現(xiàn)。

綜上，本實驗通過活性部位篩選研究多葉棘豆的抗菌作用，為該藥殺“粘”活性物質的提取分離提供了實驗依據。

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Study on Screening for Antibacterial Active Site of Oxytropis Myriophylla in Vitro

MENG Gen-xiao1,2, AO Wuliji2, HUO Wan-xue2, WANG Xiu-lan2, WANG Huan2
(1. College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2. College of Traditional Mongolian Medicine, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028300, China)

Objective To compare the antibacterial activity of the different extracts from Oxytropis Myriophylla against 6 common pathogens in vitro; To select the best active site of Oxytropis Myriophylla with antibacterial activity; To preliminarily determine the material basis for efficacy category. Methods 4 different solvent (petroleum ether, dichloromethane, ethyl acetate and normal butanol) extracts of Oxytropis Myriophylla were selected as experimental medicine. MIC was determined by microtiter plate double dilution TTC method and agar disk dilution method. MBC were tested by liquid infection method. Spectrophotometric method was adopted to determine the contents of total flavonoid in the samples. Results All extracts had the antibacterial activity in vitro. But the ethyl acetate extract was the best one that MIC and MBC against one the most sensitive pathogen (Staph. aureus) were 0.02 mg/mL and 1.25mg/mL. Followed by normal butanol extract and petroleum ether extract, the remainder had the lowest activity. Total flavonoid contents of the extracts were exactly the same order with antibacterial effects of them：that ethyl acetate extract ＞ normal butanol extract ＞ petroleum ether extract ＞ dichloromethane extract ＞ remainder. Conclusion The antibacterial activity of Oxytropis Myriophylla is closely related to flavonoid.

Oxytropis Myriophylla; solvent extracts; antibacterial activity in vitro; active site

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.013

R284.1

A

1005-5304(2016)12-0051-04

國家科技支撐計劃（2012BA128B00）

（2016-01-29）

（2016-03-21；編輯：華強）