響應面設計優(yōu)化苧麻葉黃酮提取工藝

王宗成，彭延波，盤雪，宋高銀，劉燚琳，周勇，王希

（1.湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南永州425199；2.湖南科技學院湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南永州425199；3.西安源森生物科技有限公司，陜西西安710075；4.株洲市食品藥品檢驗所，湖南株洲412000）

響應面設計優(yōu)化苧麻葉黃酮提取工藝

王宗成1，2，彭延波1，盤雪1，宋高銀1，劉燚琳1，周勇3，王希4*

（1.湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南永州425199；2.湖南科技學院湘南優(yōu)勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南永州425199；3.西安源森生物科技有限公司，陜西西安710075；4.株洲市食品藥品檢驗所，湖南株洲412000）

為優(yōu)化苧麻葉黃酮提取工藝，分別對料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)進行單因素試驗。在單因素的基礎上，以提取率為響應值，進行了經(jīng)典的Box-Benhnken三因素三水平響應面設計優(yōu)化。得到最佳工藝條件為料液比1∶43，乙醇體積分數(shù)70%，提取溫度80℃，每次提取時間90 min，提取兩次。試驗結論為提高苧麻葉黃酮利用率及其工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論參考。

響應面分析法；苧麻葉；黃酮提取

苧麻原產(chǎn)于我國，為蕁麻科苧麻屬多年生草本植物。苧麻是一種重要的纖維性經(jīng)濟作物，是我國重要的出口創(chuàng)匯經(jīng)濟作物，國際上稱“中國草”（賀波等，2010）。苧麻目前主要用于紡織工業(yè)原料，而苧麻葉作為工業(yè)廢棄品丟棄，資源浪費嚴重并污染環(huán)境?，F(xiàn)代藥學研究結果表明，苧麻葉具有豐富的藥用和保健價值（肖呈祥，2014；熊維新等，2006）。苧麻葉中含有綠原酸、原兒茶酸等有機酸和野漆樹苷、蕓香苷等黃酮苷（施樹云，2004；趙立寧等，2003）。試驗以永州野生風干苧麻葉為原料，應用響應面分析法優(yōu)化苧麻葉中黃酮的回流提取工藝，為進一步開發(fā)苧麻葉資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器試驗原材料為苧麻葉，2015年 7月下旬采摘于湖南科技學院旁西山，經(jīng)鑒定為野生苧麻品種，挑選新鮮干凈苧麻葉，采摘后，經(jīng)清洗，烘干，室溫保存于實驗室備用。蘆丁標準品、實驗用石油醚、純度為95%的乙醇、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純。

T6可見分光光度計、TE124S電子天平、RE-52B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、比色管、烘箱、燒杯、容量瓶、移液管、移液槍、膠頭滴管、玻璃棒、量筒、回流提取裝置等。

1.2黃酮含量測定的標準溶液及標準曲線的繪制標準溶液的配制為0.2 mg/mL的蘆丁標準液。分別取0、1、2、3、4、5、6 mL的0.2 mg/mL蘆丁標準溶液于7個25 mL容量瓶中，先用移液槍分別加入0.6 mL 5%的亞硝酸鈉，放置6 min，然后加0.6 mL 10%的硝酸鋁后放置6 min，最后加1.0 mol/L的NaOH 8.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置12 min得測定液，以空白溶液作參比，在λ= 510 nm處測吸光度，計算標準液濃度（C）與吸光度（A）的回歸方程A=kC+b（黃瓚，2012）。得回歸方程為：

式中，C代表蘆丁溶液的質(zhì)量濃度，A代表510 nm處的吸光度。曲線在0～0.06 mg/mL質(zhì)量濃度范圍有良好的線性關系。

1.3苧麻葉中黃酮化合物的提取及其計算按照標準曲線繪制方法，測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算出測定樣品溶液總黃酮濃度C。然后計算樣品中總黃酮的提取率。

式中：C為測定樣品溶液總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)，數(shù)值為100；V為最初樣品定容體積，mL，數(shù)值為50；m為樣品質(zhì)量，g，數(shù)值為5。

1.4單因素試驗考察料液比、提取次數(shù)、乙醇體積分數(shù)、提取溫度和提取時間五個影響因素對苧麻葉提取率的影響。

1.5響應面設計試驗在單因素試驗的基礎上選取3個對乙醇提取黃酮影響比較顯著的因素：料液比、乙醇體積分數(shù)、提取溫度，在固定提取時間90 min、提取次數(shù)2次的條件下采用經(jīng)典的三因素三水平試驗設計進行響應面試驗確定苧麻葉中黃酮提取的最佳工藝（王宗成，2015）。因素與水平見表1。

表1　苧麻葉黃酮提取工藝條件的Box-Behnken中心組合設計試驗因素與水平

2　結果與討論

2.1單因素試驗結果及分析

2.1.1料液比對提取率的影響取樣品5 g，乙醇體積分數(shù)70%，恒溫80℃，回流提取2次，每次回流90 min，研究料液比對黃酮提取率的影響，結果如圖1所示。在其他條件不變的情況下，提取率隨料液比增大而增大，當料液比為1∶40時提取率接近最大值，之后逐步下降。所以最適料液比為1∶40。

圖1　料液比對提取率的影響

2.1.2提取次數(shù)對提取率的影響取樣品5 g，體積分數(shù)為70%的乙醇，料液比1∶40，恒溫80℃，按每次90 min回流提取，研究提取次數(shù)對黃銅提取率的影響，結果如圖2所示。提取次數(shù)為2次時，黃酮提取率接近最大值，提取3次較提取2次來說差別不大，考慮到生產(chǎn)成本，故應以提取2次為宜。

圖2　提取次數(shù)對提取率的影響

2.1.3乙醇體積分數(shù)對提取率的影響取樣品5 g，料液比1∶40，恒溫80℃，回流提取2次，每次回流90 min，研究乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響，結果如圖3所示。在其他條件不變的情況下，提取率隨著乙醇體積分數(shù)增大而增大，但是超過70%時提取率逐漸下降，因此認為70%乙醇為宜。

圖3　乙醇體積分數(shù)對提取率的影響

2.1.4提取溫度對提取率的影響取樣品5 g，70%的乙醇，1∶40的料液比，回流提取2次，每次提取90 min，考察溫度高低對黃酮提取率的影響，結果如圖4所示。在其他條件不變的情況下，提取溫度對提取率有一定影響，提取溫度應以80℃為宜。

圖4　提取溫度對提取率的影響

2.1.5提取時間對提取率的影響取5 g樣品，70%的乙醇，料液比1∶40，恒溫80℃，分別在每次提取30、60、90、120 min的條件下回流提取2次，考察提取時間對苧麻葉總黃酮提取率的影響。圖5顯示提取時間對苧麻葉總黃酮提取率影響較大，隨時間延長提取率逐漸增大，提取時間達90 min以后提取率反而減少，可以看出對苧麻葉的最佳提取時間為90 min。

圖5　提取時間對提取率的影響

2.2響應面設計試驗結果及分析

2.2.1響應曲面分析與優(yōu)化由響應面圖6～8可以看出，響應面圖各試驗因素的最佳參數(shù)及各試驗因素之間的相互作用。由苧麻葉黃酮提取率（Y）對料液比（A）、提取溫度（B）、乙醇濃度（C）各試驗因素所構成的響應曲面圖可以直觀地看出交互作用對苧麻葉黃酮提取率的影響，試驗設計及試驗結果見表2。

圖6　料液比與乙醇濃度對黃酮提取率的交互作用

圖7　提取溫度與乙醇濃度對黃酮提取率的交互作用

圖8　料液比與提取溫度對黃酮提取率的交互作用

表2　苧麻葉總黃酮提取工藝條件的響應面法試驗優(yōu)化及結果

2.2.2回歸模型的方差分析從表3可以看出，模型的F=116.22、P＜0.0001，說明本試驗所采用的二次模型是很顯著的。PA、PB、PC、PAC、PBC、PA2、PB2、PC2均小于0.05，說明料液比、提取溫度、乙醇濃度、料液比和乙醇濃度的交互項、提取溫度與乙醇濃度的交互項以及3個因素的二次項都具有顯著影響；而其他交互項顯著性較差，也說明料液比與提取溫度的交互作用不大。決定因素R2= 0.9934，說明模型能夠很好地反映響應值的變化，擬合度好。各因素的效應關系為：A（料液比）＞C（乙醇濃度）＞B（提取溫度）。

2.2.3提取條件的優(yōu)化用Design-expert 8.0.5.0軟件選擇逐步回歸方法對二次多項式回歸方程做進一步優(yōu)化，最佳的提取條件為乙醇體積分數(shù)70.47%、料液比1∶43.08、提取溫度80.41℃，預測提取率為37.69 mg/g。但考慮到實際操作的可行性與便利性，將其參數(shù)修正如下：乙醇體積分數(shù)為70%、料液比為1∶43、提取溫度為80℃。

表3　苧麻葉黃酮提取工藝條件響應曲面回歸方程的方差分析

3　結論

本試驗通過響應面法設計優(yōu)化乙醇回流提取苧麻葉黃酮的工藝，采用Box-Behnken設計方案建立的二次多項數(shù)學模型能較準確地預測苧麻葉黃酮的提取率。通過響應曲面綜合分析得出了該試驗的最優(yōu)方案為：乙醇體積分數(shù)為70%，料液比為1∶43，提取溫度為80℃。本試驗所得到的工藝條件，可行性強，重復性好，為其工業(yè)化擴大生產(chǎn)和苧麻葉資源進一步開發(fā)利用提供理論基礎。

[1]賀波，李小定，彭定祥，等.苧麻葉中黃酮類化合物的提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（10）：259～262.

[2]黃瓚，李振申，王宗成.楮樹葉總黃酮提取工藝優(yōu)化[J].湖南科技學院學報，2012，33（8）：30～34.

[3]施樹云.苧麻葉和紅豆杉中活性成分的提取、純化及測定研究[碩士學位論文][D].湖南長沙：中南大學，2004.

[4]王宗成，蔣玉仁，劉小文，等.響應面優(yōu)化生姜莖葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（9）：1582～1588.

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[7]趙立寧，臧鞏固，李育君，等.苧麻（Boehmeria）綠原酸和黃酮含量測定[J].中國麻業(yè)，2003，25（2）：62～64.■

For the optimization of ramie leaves flavonoids extraction process，through the single factor experiment，the material liquid ratio，volume fraction of ethanol，extraction temperature，extraction time and times of extraction were analysed.Based on single-factor tests，Box-Benhnken three factors three levels experiment by response surface design was carried out.The results showed that optimum conditions for 1∶43 solid to liquid ratio，70%ethanol，temperature of 80℃，extraction time of 90 min，extraction two times.These results provided a theoretical reference for improving the utilization ratio of flavonoids from the ramie leaves and its industrial production.

response surface method；ramie leaf；flavonoids extraction

S816.7

A

1004-3314（2016）19-0012-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161903

湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊支持計劃資助（2012-318）；湖南省教育廳資助科研項目（15C0587）