荷花品種不同部位DNA提取的比較研究

, ， , ， ， , (.興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院, 貴州 興義 562400; 2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 40075;3.貴州省民族藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 興義 562400)

荷花品種不同部位DNA提取的比較研究

桂騰琴1,2,3,伍偉1，盧鵬1,王穎娟1，張萬芹1，馬彩瑜1,陳鵬1
(1.興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院, 貴州 興義 562400; 2.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 400715;3.貴州省民族藥用生物資源研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 興義 562400)

采用改良的3×CTAB法提取荷花品種笛女、國慶紅、紅苔蓮的葉片、葉柄和花不同部位的DNA，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測、純度檢測和ISSR分析。結(jié)果表明，除葉柄中提取的DNA效果不理想外，其余從葉片、花中提取的DNA純度高、得率高，OD260/280比值在1.80左右，OD260/230比值在2.01左右。以紅苔蓮的花為試材，對(duì)改良的3×CTAB法提取基因組DNA的參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)，選出提取DNA的最優(yōu)組合。通過荷花基因組DNA的ISSR分析,完全滿足實(shí)驗(yàn)要求。

荷花; 基因組DNA; 不同部位; 改良的3×CTAB

荷花(NelumbonuciferaGaertn.)是睡蓮科(Nymphaeaceae)蓮屬(Nelumbo)[1]的植物，也是被子植物中起源最早的古老植物之一，素有“活化石”之稱。原產(chǎn)于中國和印度,是我國十大傳統(tǒng)名花之一。

DNA分子標(biāo)記研究的前提和基礎(chǔ)就是制備高質(zhì)量的基因組DNA[2]。荷花組織中含有大量的次生代謝產(chǎn)物、多糖和多酚，這些物質(zhì)可能會(huì)干擾DNA的提取[3-4]。從富含次生代謝產(chǎn)物、多糖和多酚的荷花材料中提取高質(zhì)量的基因組DNA更加困難[5-6]。目前，絕大多數(shù)學(xué)者以幼嫩的葉片為實(shí)驗(yàn)材料[7-8]提取基因組DNA，對(duì)植物材料不同部位DNA提取的比較研究報(bào)道較少。另外，對(duì)改良的3×CTAB法提取基因組DNA的參數(shù)進(jìn)行正交試驗(yàn)也很少報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材 料

荷花品種笛女，國慶紅，紅苔蓮的葉片、葉柄、花，均采自安龍招堤荷花池，采摘后用清水沖洗吸干后置于硅膠中干燥。

1.2 主要試劑

改良的3×CTAB法主要試劑。

STE核分離液:700 mmol/L NaCl;100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0);50 mmol/L EDTA (pH=8.0);2% PVP (W/V);2%β-巰基乙醇 (V/V)。

3×CTAB 核裂解液:100 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0);50 mmol/L EDTA (pH=8.0);1.4 mol/L NaCl;3% CTAB (W/V);2% PVP (W/V)。

“PCN”溶液：0.067 5 g PVP,45μL 10% CTAB+4% NaCl。

1.3 DNA提取

1.3.1 改良的3×CTAB法具體步驟

參照桂騰琴[9]的提取方法略有改動(dòng)。

1) 分別稱取硅膠干燥笛女、國慶紅，紅苔蓮的葉片、葉柄、花各0.2 g于滅過菌的預(yù)冷的研缽里,加入少量的PVP和2%β-巰基乙醇,用液氮研磨樣品成粉末狀立即加入600μL STE 核分離緩沖液,迅速研磨成糊狀勻漿,小心轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,上下顛倒混勻。

2) 4℃下5 000 r/min離心10 min,取出棄上清。若上清很粘稠,用STE核分離液反復(fù)清洗后離心。

3) 在沉淀中加入65 ℃預(yù)熱的3×CTAB核裂解液600μL和10μLβ-巰基乙醇,將材料輕輕混勻。65 ℃水浴60 min,每隔幾分鐘輕輕搖動(dòng)離心管1次。

4) 取出冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(體積比24∶1)和“PCN”溶液(0.067 5 g PVP,45μL 10% CTAB+4% NaCl)搖勻,室溫靜置5 min后10 000 r/min 離心10 min。

5) 把上清液轉(zhuǎn)入新的離心管,重復(fù)抽提2～3次,每次抽提時(shí)都加入“PCN”溶液去多糖。

6) 取上清，加入RNaseA 至終濃度為10μg/mL,37 ℃水浴保溫30 min。取出后加入1/5體積 5 mol/L NaCl和2倍體積預(yù)冷的乙醇,顛倒搖勻,-20 ℃靜置30 min沉淀DNA。

7) 挑出DNA集結(jié)成白色絮狀，用70%的乙醇清洗2次,室溫風(fēng)干后溶于50μL TE中,放在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA提取的正交試驗(yàn)

以荷花品種紅苔蓮的花瓣(硅膠干燥)為試材，進(jìn)一步研究改良的3×CTAB法提取DNA過程中第1)步磨樣前加入PVP和β-巰基乙醇量多少，第3)步水浴時(shí)間、第4)步離心轉(zhuǎn)數(shù)等參數(shù)對(duì)提取DNA的影響,選用L9(34)正交表，因素-水平及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 DNA提取參數(shù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

編號(hào)PVP水浴時(shí)間(min)離心轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)β?巰基乙醇(μL)11%408000522%6080001033%508000541%50100001052%4010000563%60100001571%60110001582%50110001593%401100010

1.4 DNA的檢測方法

1.4.1 比色檢測

DNA的純度和濃度用紫外分光光度計(jì)檢測，并根據(jù)公式計(jì)算DNA產(chǎn)率[10]。

1.4.2 電泳檢測

取DNA原液10μL和2μL上樣緩沖液，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相和分析。

1.4.3 PCR檢測

用改良的3× CTAB 法的最佳組合提取16個(gè)荷花栽培品種的DNA為模板進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增用引物為UBC 811，擴(kuò)增體系參照桂騰琴[11]略有改動(dòng)，即25μL反應(yīng)體系中含0.2 mmol/L dNTPs,0.32μmol/L引物,10×buffer 2.5μL,2.0 mmol/L Mg2+,40 ng模板DNA,1 UTaqDNA聚合酶,用滅菌純凈水補(bǔ)至總體積為25μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,50.6 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。用1.4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)染色和電泳后，照相并分析。

注：1、2、3分別為笛女、國慶紅、紅苔蓮花的DNA；4、5、6分別為笛女、國慶紅、紅苔蓮葉片的DNA；7、8、9分別為笛女、國慶紅、紅苔蓮葉柄的DNA。圖1 3個(gè)荷花品種不同部位DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

注：1～9分別代表表1的9種組合提取DNA。圖2 正交試驗(yàn)提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖3 引物UBC 811對(duì)部分荷花品種擴(kuò)增的ISSR帶型

2 結(jié)果與分析

2.1 荷花品種不同部位DNA純度和產(chǎn)率的測定

表2 荷花品種不同部位提取DNA的檢測結(jié)果

品種提取部位OD260/280OD260/230DNA產(chǎn)率(μg/g)DNA外觀葉柄1．461．54654．68淺棕色笛女葉片1．792．03440．34無色透明花1．802．03458．26無色透明葉柄1．681．57624．32微褐色國慶紅葉片1．821．92490．62無色透明花1．822．06460．68無色透明葉柄1．251．40587．32淺黃色紅苔蓮葉片1．751．86502．16無色透明花1．802．13478．66無色透明

從表2可以看出，3個(gè)品種的葉片、葉柄、花都能獲得其基因組DNA,但是葉片和花基因組DNA,其OD260/280比值為1.75～1.82,平均1.80左右，表明提取的DNA純度較高，無蛋白質(zhì)、RNA、酚類及小分子等污染；而葉柄中提取的DNA,OD260/280比值為1.46左右(表2),OD260/230比值為1.40～1.57，平均為1.50，表明RNA及酚類去除不干凈。總之，從葉片和花中提取DNA，比較純。就DNA的產(chǎn)率而言,“葉柄中提取的DNAgt;葉片的DNAgt;花的DNA”(表2)。

2.2 DNA的電泳檢測

3個(gè)荷花品種不同部位提取DNA的瓊脂糖凝膠如圖1所示，1～6點(diǎn)樣孔處干凈無熒光，去除蛋白質(zhì)、多糖徹底，DNA主帶清晰無降解。點(diǎn)樣孔7,8,9分別是笛女、國慶紅和紅苔蓮的葉柄DNA,點(diǎn)樣孔處發(fā)亮，說明蛋白質(zhì)、多糖去除不徹底,DNA有降解，RNA去除不徹底。

2.3 正交試驗(yàn)?zāi)z電泳檢測結(jié)果

圖2所示，正交實(shí)驗(yàn)中第8種組合提取DNA條帶完整，點(diǎn)樣孔處無雜質(zhì)，效果最好，第5種組合效果最差。即改良的3×CTAB法提取基因組DNA時(shí)，第1)步磨樣前加入PVP含量為2%、β-巰基乙醇15μL、第3)步水浴時(shí)間為50 min、第4)步離心轉(zhuǎn)數(shù)11 000轉(zhuǎn)，獲得DNA純度高，條帶完整。

2.4 ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果檢測

圖3所示，用改良的3×CTAB法的最佳組合提取的荷花品種DNA為模板進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，條帶清晰，多態(tài)性條帶豐富，說明此方法提取的DNA完全符合ISSR-PCR擴(kuò)增需要。

3 討 論

有研究表明，葉柄、老葉、根等組織器官中的酚、萜等次生代謝產(chǎn)物及多糖、蛋白質(zhì)等對(duì)DNA的提取造成了困難[12]，且這些物質(zhì)隨組織器官的增長而增加[10]。因此，實(shí)驗(yàn)室在提取荷花葉柄DNA、梨、桃等成熟葉片DNA時(shí)，提取DNA效果不理想。

荷花品種在沒有開花之前，葉片及外形極其相似，因此，幼嫩葉片的采集給品種的鑒定帶來了困難。幼葉的采集常常受到采集時(shí)間和季節(jié)的約束。野外采集樣品時(shí)為保持材料的新鮮度經(jīng)常用液氮迅速冷凍，但液氮的攜帶不方便，所以在野外采集或采樣時(shí)間較長時(shí)，可將采集到的材料置于變色硅膠中干燥，可有效防止植物細(xì)胞死亡過程中次生物質(zhì)的釋放和DNA的降解[13-14]。

在改良的3×CTAB法提取DNA的過程中，對(duì)PVP、β-巰基乙醇、水浴時(shí)間、離心轉(zhuǎn)數(shù)等參數(shù)進(jìn)行了正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果第1)步磨樣前加入PVP含量為2%、β-巰基乙醇15μL、第3)步水浴時(shí)間為50 min、第4)步離心轉(zhuǎn)數(shù)11 000轉(zhuǎn)，獲得DNA純度高，條帶完整。在磨樣前，加入2% PVP和β-巰基乙醇15μL能有效防止磨樣和水浴過程中酚類氧化成醌[15]。陳靜[16]、劉紅艷[17]等用改良CATB法提取DNA時(shí)，在CTAB提取液中加入PVP 40，100 mmol/Lβ-巰基乙醇和10 mmol/L Na2S2O5,能獲得高質(zhì)量DNA。這些組合是提取中的關(guān)鍵步驟，能有效除去多糖和多酚等物質(zhì)。而組合5，PVP含量為2%、β-巰基乙醇5μL時(shí)，提取的DNA為褐色，植物組織氧化嚴(yán)重，提取DNA的量少。

植物基因組DNA提取質(zhì)量的好壞與樣品的采集部位、保存方法[18]和提取方法[19-21]等有關(guān)。因此，在DNA提取過程中要綜合考慮各種因素，才能獲得高質(zhì)量、比較純的基因組DNA，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

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(本欄目責(zé)任編輯：周介雄)

Comparative Study on Extraction of DNA from Different Parts ofNelumbonuciferaGaertn.

GUITengqin1 ,2,3,WUWei1,LUPeng1，WANGYingjuan1,ZHANGWanqin1,MACaiyu1，CHENPeng1
(1.School of Biology and Chermistry,Xingyi Normal University for Nationalities,Xingyi Guizhou 562400,China;2.College of Life Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;3.Research and Development of Biological Resources,Key Laboratory of National Medicine,Xingyi Guizhou 562400,China)

Genomic DNA ofNelumbonuciferaGaertn.was extracted from different parts of three cultivars ofNelumbonuciferaGaertn.,Dinv,Guoqinghong,and Hongtailian. Yield and purity of total genomic DNA was detected by agarose gel electrophoresis and UV-spectrophotomoter.Results showed that,extraction effect of DNA from the petiole was not ideal,the purity of DNA extracted from the leaves and flowers were high.OD260/280was 1.80 or so.OD260/230was 2.01 or so.Taking the flowers of cultivars Hhongtailian as material,orthogonal experiment was carried out on the parameters of genome DNA extracted by the modified 3×CTAB method,and the optimal combination of DNA extraction was selected.When tested through the DNA-ISSR analysis,experiment requirement was met perfectly.

NelumbonuciferaGaertn.; genomic DNA; different parts; the modified CTAB method

2016-02-10

貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目(編號(hào)：黔科合LH字[2014]7413號(hào))；2015年國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.201510666015)。

桂騰琴(1977—)，女(回族)，貴州安龍人；副教授，理學(xué)碩士，主要從事植物生物技術(shù)的研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.07.041

S 682.32

A

1001-4705(2016)07-0041-04