蓮瓣蘭大雪素AP1 MADS-box基因的克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析

， ， ， (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點實驗室和工程中心， 昆明 650201)

蓮瓣蘭大雪素AP1 MADS-box基因的克隆和系統(tǒng)發(fā)育分析

劉濤，普衛(wèi)瓊，趙銀河，于仲艷
(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點實驗室和工程中心， 昆明 650201)

隨著植物中越來越多的MADS-box基因被克隆出來，人們對經(jīng)典的ABC模型進行了改進和完善，提出花發(fā)育的ABCDE模型，通過RT-PCR和RACE技術(shù)從蓮瓣蘭大雪素花器官中克隆得到AP1同源基因AP1a和AP1b的cDNA全長：AP1a基因全長為1 054 bp，其開放閱讀框為744 bp；AP1b基因全長為944 bp，其開放閱讀框為516 bp。從蓮瓣蘭大雪素中得到2個AP1同源基因，說明在大雪素中AP1出現(xiàn)基因松弛，所以出現(xiàn)多個拷貝。通過序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，蓮瓣蘭AP1a基因與春蘭具有很高的相似度，達到99.1%，蓮瓣蘭AP1b基因與萼脊蘭具有中等程度的相似度，達75.8%，但從大雪素花器官提取的同源基因AP1a和AP1b的相似度很低，僅為65.4%。這表明AP1基因在不同品種植物間具有保守性，而在同一個物種中又存在著功能的分化。

蓮瓣蘭大雪素；AP1基因； 克??； 系統(tǒng)發(fā)育分析

全球開花植物已知有25 000多種，在陸地生態(tài)系統(tǒng)中占有明顯的優(yōu)勢。開花是高等植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)向生殖生長的一個重要的生理過程, 開花既受外界環(huán)境因素的影響, 又受內(nèi)在基因的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，MADS-box基因在花發(fā)育過程中起著重要作用[1]。

隨著花器官發(fā)育研究的深入,有關(guān)花器官發(fā)育相關(guān)基因的研究已取得了很大的進展。這些雙子葉植物的花由同心圓的四輪結(jié)構(gòu)組成，從外向內(nèi)依次為：第1輪萼片，第2輪花瓣，第3輪雄蕊，第4輪心皮[2]。按照變異器官分布的空間順序，這些突變體分為3類：第1類突變體的萼片轉(zhuǎn)化為心皮，花瓣轉(zhuǎn)化為雄蕊，導(dǎo)致花的組成由外至內(nèi)依次為心皮-雄蕊-雄蕊-心皮；第2類突變體將花瓣轉(zhuǎn)化為萼片，雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮，花組成為萼片-萼片-心皮-心皮；第3類突變體雄蕊轉(zhuǎn)化為花瓣，心皮轉(zhuǎn)化為類似萼片的結(jié)構(gòu)，花組成為萼片-花瓣-花瓣-萼片，并且在心皮內(nèi)不斷產(chǎn)生不確定的花器官，這些花器官類似于萼片與花瓣組織[3-6]。

在擬南芥中,A類基因有2 個,APETALA1(AP1)和AP2,其中AP1有2 個旁系同源基因, 分別為CAULIFLOWER(CAL)和FRUITFULL(FUL)；B類基因2個,APETALA3(AP3)和PISTILLATA(PI)；C類基因主要是AGAMOUS(AG),它有3 個旁系同源基因SEEDSTICK(STK),SHATTERPROOF1 (SHP1)和SHP2；E類基因有4 個,SEPALLATA1 (SEP1),SEP2,SEP3,SEP4[3]。除AP2外, 這些基因都為一類結(jié)構(gòu)上非常保守的Ⅱ型MADS-box基因[2]。AP1基因?qū)儆诨ǚ稚M織特征基因，調(diào)控花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變。

蓮瓣蘭(Cymbidiumtortisepalum)是中國春蘭的一個新品系， 大雪素滇蘭為四大名品之首，寬葉蓮瓣素白花素心品種。俗稱大素心，已有數(shù)百年的栽培歷史，原產(chǎn)于滇西的部分地區(qū)[7]。本研究以蓮瓣蘭大雪素做實驗材料，用RACE方法快速地克隆全長cDNA，從花的器官材料中分離開花相關(guān)SEP1基因并進行克隆。通過對蓮瓣蘭大雪素AP1基因的初步研究，了解AP1基因是植物花器官調(diào)控途徑的一個重要因子。

1 材料與方法

1.1 材 料

所采用材料為蓮瓣蘭大雪素(Cymbidiumtortisepalum)，是中國蘭花中的優(yōu)秀品種，也是滇蘭蓮瓣蘭中的一顆明珠，是蓮瓣蘭中的優(yōu)秀代表品種[7]。它盛開在元旦春節(jié)，花枝高挺出架，花朵潔白，具有暗香。

1.2 必要培養(yǎng)液的配置

200 mL LB培養(yǎng)液的配制：2 g胰蛋白胨、1 g酵母提取物、1 g NaCl(pH=7)，若配制固體培養(yǎng)基則加3 g瓊脂。

1.3 實驗設(shè)備

計算機、PCR儀、電泳槽、離心機、振蕩床、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、滅菌鍋、烘箱、移液設(shè)備、容器、刮子等。

1.4 RNA的提取

選用TransZol Plant(TransGen Biotech，Beijing，code#ET 121-01)提取大雪素花器官的RNA，嚴(yán)格按照試劑盒進行。

1.5 特異性引物設(shè)計

3′-RACE CDC Primer

5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3

AP 1-F 5- CAACACTTTACTGCCGCCA-3

AP 1-R 5- GCGAGCACAGAATTAATACG-3

1.6 cDNA的合成

按SMART RACE cDNA Amplication Kit操作流程進行。3’SMART-RACE PCR加入以下試劑于滅菌的PCR反應(yīng)管中：Total RNA,2μg；10×Advantage PCR Buffer,5μL;dNTP mix(10 mmol/L),4μL;Primers (10μmol/L),各0.75μL;Advantage 2 Polymerase Mix,2μl;ddH2O 17.75μL?；旌弦陨显噭?，短暫離心，將反應(yīng)管放在預(yù)熱的PCR儀上，按下列程序進行循環(huán)：

35的循環(huán)，94 ℃×3 min 30 s，94 ℃×20 s,57 ℃×30 s,72 ℃×1 min，72 ℃×7 min,4 ℃×∞。

循環(huán)結(jié)束后，取5μL樣品在1%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測合成情況。

1.7 電泳檢測，割膠回收目的片段

取5μL的PCR產(chǎn)物進行克隆，克隆方法參照文獻[8]，隨機篩選白色菌落，送北京華大基因公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE克隆蓮瓣蘭大雪素(Cymbidium tortisepalum)AP1基因的全長

用轉(zhuǎn)錄組測序方法獲得了AP1基因的序列,在NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/database中進行功能預(yù)測是FT的 5′端序列。為了進一步研究這些基因的功能及表達特性，克隆了全長序列cDNA。對瓣蘭大雪素不同發(fā)育時期的花原基、花蕾以及合蕊柱混合樣品進行Total RNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳方法監(jiān)測RNA的質(zhì)量；以Total RNA為模板，按照RACE試劑盒的說明進行反轉(zhuǎn)錄后得到3′端和5′端cDNA模板, 對3′端的cDNA模板進行特異引物和Outprimer進行PCR擴增，獲得3′端片段，然后5′端與3′ 端的序列進行拼接，在5′和3′端設(shè)計特異引物，再一次進行全長cDNA的克隆，對菌液PCR進行進一步的測序，獲得了這個基因的全長cDNA。這個基因cDNA 全長為 662 bp, 包含有編碼框,1個長為34 bp的 5′UTR和103 bp 3′UTR的非翻譯區(qū)，具有完整的開放閱讀框(ORF)522 bp,編碼173氨基酸的蛋白質(zhì)，如圖1。從蓮瓣蘭大雪素中分離出來的FT基因。

2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育分析

CtAP1推定的氨基酸序列與石斛蘭(DendrobiumgrexMadameThong-IN)、金釵石斛(Dendrobiumnobile),朵麗蝶蘭(Doritaenopsishybridcultivar)，珍稀細(xì)莖石斛(Oncidiumhybridcultivar)和小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsisequestris)等蘭花以及單子葉植物AP1早竹(原栽培型) (Phyllostachyspraecox)都具有較高的相似性，與其它單子葉植物也有一定的相似性。圖2 是CtAP1 基因推定的氨基酸序列與其他物種AP1 基因的氨基酸序列比對結(jié)果，結(jié)果顯示AP1 氨基酸序列的5′端保守性較高，而3′端保守性較低，這是MADS-MADS-box基因的典型特征，并在C 端存在單子葉植物APl/SQUA基因所特有的paleoAPl(LPPWML)結(jié)構(gòu)域。

圖1 編碼氨基酸的序列

圖2 AP1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的比較

從圖3中可以看出，用ME法對來自于蓮瓣蘭大雪素的AP1基因進行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，通過系統(tǒng)發(fā)育重建發(fā)現(xiàn)，從蓮瓣蘭大雪素中分離出來的AP1基因與來自于蘭科的石斛蘭(DendrobiumgrexMadameThong-IN)、金釵石斛(Dendrobiumnobile),朵麗蝶蘭(Doritaenopsishybridcultivar)，石斛蘭(Dendrobiumhybridcultivar)，珍稀細(xì)莖石斛(Oncidium hybrid cultivar)以及小蘭嶼蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)的AP1基因具有支持率并聚為一枝，并且支持率達到99%(圖3)。同時與其他蘭科和單子葉植物AP1早竹(原栽培型) (Phyllostachys praecox)具有很高的支持率，達到99%(圖3)。

圖3 AP1 MADS-box基因的進化分析

本實驗以三百草作為材料分離出AP1基因，通過RACE方法從蓮瓣蘭大雪素中快速分離出AP1全長cDNA，獲得全長約為1 000 bp的cDNA，通過測序分析，確定該基因為AP1MADS-box的全長cDNA序列，共編碼241個氨基酸。AP1基因?qū)儆诨ǚ稚M織特征基因，又是花器官形態(tài)特征基因，AP1基因有促進植物開花的作用，且此作用在不同植物間具有保守性。

AP1基因在花器官發(fā)育上起關(guān)鍵作用。在花發(fā)育的ABCDE模型中，AP1基因?qū)儆贏類基因，是萼片和花瓣正常發(fā)育所必需的[2]。通過對擬南芥和金魚草中花的同源異型突變體的研究，Coen等[8]最早提出花器官發(fā)育的ABC模型，用于解釋花的同源異型基因在器官形成中的作用?，F(xiàn)已在擬南芥中克隆到具有A功能的基因有AP1和AP2，具 B功能的有AP3和PI，具C功能的有AG。相應(yīng)在其它種類如金魚草、煙草、西紅柿、矮牽牛中亦分別克隆到類似的基因。上述所有種類中，控制同一功能的不同植物基因的功能、表達方式，所表達的氨基酸序列都具有高度的相似性[9]。

[1]馬輝,張智俊,羅淑萍.植物MADS-box基因研究進展[J].生物技術(shù)通報,2006(6):14-18.

[2]Coen ES,Meyerowitz EM.The war of whorls:Genetic interactions controlling flower development[J].Nature,1991,353:31-37.

[3]Gao X,W Liang,C Yin,et al.The SEPALLATA-like gene OsMADS 34 is required for rice inflorescence and spikelet development[J].Plant Physiol,2010,153(2):728-40.

[4]Cseke LJ,SB Cseke,N Ravinder,et al.SEP-class genes in Populus tremuloides and their likely role in reproductive survival of poplar trees[J].Gene,2005,358:1-16.

[5]Shore P,SharrocksAD.The MADS-box family of transcription factors[J].Eur J Biochem,1995,229(1):1-13.

[6]叢楠,程治軍,萬建民.控制花器官發(fā)育的 ABCDE 模型[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2007,23(7):124-127.

[7]陳貴.云南名蘭大、小雪素[J].中國花卉園藝,2001,17:45.

[8]袁秀云,蔣素華,田云芳,等.1個蘭花MADS-box基因的克隆與表達分析[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,47(6):683-691.

[9]張則婷,李學(xué)寶.MADS-box基因在植物發(fā)育中的功能[J].華中師范大學(xué)植物生理學(xué)通訊,2007,43(2):198-202.

Isolation and Phylogenetic Analysis ofAP1 Gene fromCymbidiumtortisepalum

LIUTao,PUWeiqiong，ZHAOYinhe,YUZhongyan
(Key Laboratory of Crop Germplasm Innovation and Sustainable Utilization and and Engineering Center,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China)

With more and more plantMADS-boxgenes have been cloned,the classic ABC model has been improved,and ABCDE model of flower development had formed.Using rapid amplification of cDNA ends (RACE) amplified the full-lenth cDNA ofAP1aandAP1b.the full lenth cDNA ofAP1awas 1 054 bp,contained one ORF(744 bp),the full lenth cDNAof AP1b was 944 bp,and it contained one ORF for 516 bp.This suggest thatAP1 shows gene loose and come out with may copy inCymbidiumtortisepalum.The phylogenetic analysis ofAP1aandAP1bgene ofCymbidiumtortisepalumshow thatAP1ainCymbidiumtortisepalumwas similar with that in Cymbidium faben with the similarity of 99.1%,howeverAP1bwas similar with sedirea japonica with the similarity of 65.4%. And the similarity betweenAP1aandAP1binCymbidiumtortisepalumwas only 65.4%.This suggests thatAP1 gene show the conservative in different plant,but it also show functional differentiation in the same species.

Cymbidiumtortisepalum;AP1 genes; clone; phylogenetic analysis

2016-01-19

國家自然科學(xué)基金(編號：NSFC 31060166 and NSFC 31460053)；云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才(編號：2012 HB 018)資助。

劉 濤(1978—)，男，博士，副教授，主要從事藥用植物學(xué)研究。

趙銀河(1967—)，女，副教授，遺傳學(xué)博士，主要從事發(fā)育生物學(xué)；E-mail：yhzhao808@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.07.014

S 682.31

A

1001-4705(2016)07-0014-04