環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)及其在鴨病病原檢測中的應(yīng)用研究進展

于新友 李天芝 苗立中

摘 要：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)是一門新興的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，因其具有特異性強、靈敏度高、快速、準確和操作簡便和成本低等特點，越來越受到獸醫(yī)相關(guān)工作者的關(guān)注。目前，該方法己被廣泛應(yīng)用各種動物病原的檢測。本文綜述了LAMP 技術(shù)在鴨傳染病病原檢測中的應(yīng)用研究進展情況，以期為今后鴨病的診斷和防控工作提供參考。

關(guān)鍵詞：LAMP；鴨?。徊≡?；檢測；應(yīng)用

中圖分類號：S818.9 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2016）04-0043-06

鴨傳染病對養(yǎng)鴨業(yè)的威脅時刻存在，目前養(yǎng)殖場主要是將病料送專業(yè)檢測實驗室進行病原分離鑒定或PCR檢測，一旦出現(xiàn)疫情，由于條件所限，很難實現(xiàn)對疫病的快速檢測。日本學(xué)者Notomi 等[1]開發(fā)了一種新型核酸擴增技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，該技術(shù)不需要模板的熱變性[2]、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳和紫外觀察等過程，整個反應(yīng)在恒溫條件下進行，反應(yīng)結(jié)束后，結(jié)果可用肉眼直接觀察[3]，在疫病診斷領(lǐng)域顯示了廣闊的應(yīng)用前景，本文就LAMP技術(shù)及其在鴨病病原檢測中的應(yīng)用研究進展綜述如下。

1 LAMP技術(shù)

1.1 LAMP擴增原理 LAMP技術(shù)是針對靶基因6個區(qū)域設(shè)計4條特殊引物，利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在65℃左右溫度下，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，完成對目標DNA的大量擴增。在LAMP反應(yīng)中，內(nèi)引物雜交在目標DNA區(qū)，啟動互補鏈合成，導(dǎo)致啞鈴狀DNA產(chǎn)生。這種結(jié)構(gòu)很快以自身為板，進行DNA合成延伸，形成莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，然后以此結(jié)構(gòu)作為LAMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。由于內(nèi)引物雜交在莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成的DNA產(chǎn)生一個有缺口的莖-環(huán)DNA中間媒介，在莖上附有目標序列。再通過外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果在同一鏈上互補序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。

1.2 LAMP引物設(shè)計 首先在靶基因的3'末端設(shè)定F3c、F2c、F1c三個區(qū)段，在5'末端設(shè)定B1、B2、B3三個區(qū)段。針對這六個區(qū)段設(shè)計四條引物，包括一對內(nèi)部引物和一對外部引物。上游內(nèi)部引物FIP：在3'末端含有與F2c互補的F2區(qū)段，在5'末端含有與F1c相同序列的區(qū)段下游內(nèi)部引物BIP：在3'末端含有與B2c互補的B2區(qū)段，在5'末端含有與B1c相同序列的區(qū)段。上游外部引物F3：含有與目標DNA上的F3序列相同的區(qū)段。下游外部引物B3：含有與目標DNA的B3相同序列的區(qū)段，各引物組成及對應(yīng)區(qū)域如下圖1所示。

[圖1 LAMP的引物組成及對應(yīng)區(qū)域]

引物的設(shè)計要注意以下幾個問題：①擴增領(lǐng)域為F2～B2區(qū)段間，應(yīng)該在200bp以內(nèi)；②包含F(xiàn)2/B2在內(nèi)的環(huán)狀部分的長度在40～60bp范圍內(nèi)；③各區(qū)段的Tm值應(yīng)該在60～65℃之間；④若只是為了鑒定靶基因存在與否，F(xiàn)1～B1的間距可以為零；⑤引物應(yīng)避免二次結(jié)構(gòu)發(fā)生；⑥各引物的3'端不可含有與其他引物互補的序列。

1.3 LAMP技術(shù)特點 LAMP技術(shù)特點具有以下特點：①操作簡便、耗時短、成本低，擴增反應(yīng)在等溫下持續(xù)進行，只需在恒溫水浴鍋中幾十分鐘即可完成，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進行雙鏈DNA的變性，適合在基層養(yǎng)殖場的推廣應(yīng)用；②擴增的效率高，沒有PCR反應(yīng)中溫模板的退火、復(fù)性過程，在15～60min內(nèi)可擴增109～1010倍，能滿足臨床病料樣本快速檢測的需要；③特異性高，由于是針對靶序列6個區(qū)域設(shè)計的4種特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故其特異性極高。針對六個區(qū)段使用四種不同的引物，可特異性擴增靶基因序列；④靈敏度高，檢測的敏感性是常規(guī)PCR的10倍，擴增模板可達10拷貝或更少；⑤僅使用一種鏈置換型BstDNA聚合酶，因BstDNA聚合酶是一種不耐熱的DNA聚合酶，因此必須在模板預(yù)變性以后再加樣；⑥擴增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)；⑦當(dāng)模板是RNA時，僅需加入逆轉(zhuǎn)錄酶即可與DNA一樣進行擴增。

1.4 反應(yīng)產(chǎn)物的檢測 LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的檢測方法主要有五種：①以2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察是否有典型的梯狀條帶泳判定結(jié)果；②以擴增產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀的產(chǎn)生用肉眼直接判斷擴增反應(yīng)是否進行；③反應(yīng)體系中加入溴化乙錠、SYBR Green Ⅰ等染料，通過觀察擴增結(jié)果是否產(chǎn)生相應(yīng)顏色來判定是否有目的片段擴增；④通過恒溫擴增微流控芯片實時觀察反應(yīng)結(jié)果；⑤運用實時濁度儀監(jiān)測反應(yīng)結(jié)果。

2 在鴨病毒病檢測中的應(yīng)用

2.1 鴨病毒性肝炎病毒檢測 鴨病毒性肝炎是由鴨病毒性肝炎病毒（DHV）引起的一種急性、高度致死性傳染病。主要危害1～3周齡雛鴨，死亡率高達90%～95%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。該病于1945年首次在美國發(fā)現(xiàn)，隨后相繼在世界多數(shù)國家報道了該病的流行。DHV可分為I型、Ⅱ型和Ⅲ型3種血清型，其中I型（DHV-Ⅰ）為臨床上常發(fā)的血清型。謝麗基等[4]根據(jù)基因庫中DHV Ⅰ基因的保守序列，設(shè)計特異性LAMP引物，建立了DHV I的RT-LAMP可視化檢測方法。該方法的敏感性可達10fg，高于常規(guī)PCR方法100倍，全部反應(yīng)可在1h內(nèi)完成，可以通過肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果，對其它鴨常見病原體的檢測結(jié)果均為陰性。胡成等[5]根據(jù)GenBank中登錄的DHV-I VPl基因的高度保守序列，設(shè)計了特異性的引物，建立了一種靈敏、特異、高效的可視化體外環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法。結(jié)果表明，該方法的靈敏性可達到10fg，是常規(guī)一步法RT-PCR方法的100倍以上。全部反應(yīng)可以在1.0～1.5h內(nèi)完成，并可以直接通過肉眼觀察頗色進行結(jié)果判定，該方法對其他鴨常見的病原體檢測結(jié)果全部為陰性。

2.2 鴨坦布蘇病毒檢測 鴨坦布蘇病毒（DTMUV）可引起鴨的坦布蘇病，感染鴨群的發(fā)病率高達100%，死亡率在5%～15%，臨床表現(xiàn)為高熱、蛋鴨產(chǎn)蛋率嚴重下降、部分感染鴨拉綠色稀便并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，病理剖檢主要表現(xiàn)為卵巢充血、出血、萎縮、壞死，卵泡破裂，心內(nèi)膜出血，脾臟腫大，該病給養(yǎng)鴨業(yè)造成的經(jīng)濟損失達數(shù)十億元[6]。張偉等[7]參考NCBI中已收錄的DTMUV E基因保守區(qū)域設(shè)計了6條引物，通過對反應(yīng)體系中各組分和條件進行優(yōu)化，建立了DTMUV LAMP檢測體系，并應(yīng)用熒光顯色劑（SYBR GreenⅠ和鈣黃綠素、錳離子）對擴增產(chǎn)物進行可視化判定。結(jié)果顯示，以SYBR GreenⅠ為染料，顯色敏感性為10copies/μl的病毒，比普通PCR高100倍，以鈣黃綠素和錳離子組合作為顯色劑，其顯色極限為1000copies/μl的病毒，雖低于SYBR GreenⅠ的顯色敏感性，但能有效地避免氣溶膠造成的空氣環(huán)境污染。董嘉文等[8]根據(jù)DTMUV E基因保守區(qū)域設(shè)計了一套引物，建立了檢測DTMUV的RT-LAMP方法，該法的最低檢測限可達7.8copies，其靈敏度是普通RT-PCR的100倍，對其它常見鴨源病毒核酸擴增結(jié)果均為陰性。

2.3 鴨瘟病毒檢測 鴨瘟是由鴨瘟病毒（DPV）引起的鴨、鵝等水禽的敗血性、高度致死性傳染病，其特征為兩腿麻痹、下痢、流淚和部分病鴨頭頸腫大。是危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴重的傳染病之一[9]，是OIE規(guī)定的B類傳染病，給世界各國養(yǎng)鴨業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失。許宗麗等[10]根據(jù)Gen Bank中DPV UI6基因的保守序列設(shè)計一套特異性引物，并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立DPV的LAMP可視化檢測方法。結(jié)果：建立的LAMP方法對其他鴨常見病原體無擴增反應(yīng)，可通過肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果，敏感性可達0.1fg，是常規(guī)PCR方法的100倍，擴增反應(yīng)只須在常規(guī)水浴鍋中進行，可在1h內(nèi)完成。張坤等[11]根據(jù)GenBank中登錄的DPV基因組序列，設(shè)計3對特異性的LAMP引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系，建立了LAMP快速檢測方法。結(jié)果表明，LAMP方法能夠在63℃恒溫下，1h內(nèi)實現(xiàn)目的核酸的大量擴增。結(jié)果判定時只需要在擴增產(chǎn)物中加入SYBRGreenⅠ染料，就可以直接在可見光或紫外光下觀察顏色變化。該方法敏感性可達0.245μg/L，比普通PCR靈敏性高10倍，對DHV、H9N2亞型禽流感病毒、鴨副黏病毒、鴨源偏肺病毒等的核酸無交叉反應(yīng)。

2.4 鴨流感病毒檢測 禽流感是由禽流感病毒（AIV）引起的禽類一種急性、高度接觸性傳染病。主要侵害禽類的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等。AIV根據(jù)糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同分為16個HA亞型和10個NA亞型[12]，理論上可形成160種不同的禽流感病毒亞型，且不同亞型的病毒基因組會發(fā)生片段重組，造成病毒變異。王辰雨等[13]參考AIV 基質(zhì)蛋白（M）基因設(shè)計了兩對引物，特異性識別其6個不同位點，建立了基于顏色判定的LAMP方法。試驗對不同禽源病毒進行了測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法僅特異性地檢出禽流感病毒（H9和H5亞型）核酸，對AIV病毒的檢測極限為10EID50。石霖等[14]針對AIV M基因設(shè)計了4個不同區(qū)段的特異性引物，并對反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進行優(yōu)化，建立了AIV的RT-LAMP方法。結(jié)果表明，該方法對AIV H1～H16亞型的檢測結(jié)果均為陽性，而對其他禽類病毒的擴增均為陰性，具有良好的特異性。對AIV的最低檢測限為13.43EID50/ml，靈敏度為普通一步RT-PCR的10倍，擴增反應(yīng)可以在恒溫水浴內(nèi)60min內(nèi)完成，在反應(yīng)體系中添加熒光染料后，肉眼即可判定檢測結(jié)果。該檢測方法與RT-PCR方法和熒光定量RT-PCR方法對臨床樣品檢測的符合率均為81.8%。

2.5 鴨細小病毒檢測 番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒（MPV）引起急性傳染病。該病主要危害3周齡內(nèi)雛番鴨，病鴨臨床表現(xiàn)為張口呼吸、喘氣，消瘦、拒食、蹲伏，病例表現(xiàn)為十二指腸內(nèi)容物呈松散栓子狀，表層有脫落的粘膜附著，胰臟呈點狀壞死，死亡率可達80%以上[15]，是目前番鴨飼養(yǎng)業(yè)中危害最嚴重的傳染病之一。謝麗基等[16]根據(jù)GenBank登錄的MDPV基因的保守序列，設(shè)計一套特異性LAMP引物，建立了MDPV的LAMP可視化檢測方法。該方法的敏感性可達10fg，高于常規(guī)PCR方法10倍，全部反應(yīng)可在1h內(nèi)完成，可通過肉眼觀察顏色直接判定結(jié)果，對其它鴨常見病原體的檢測結(jié)果均為陰性。

2.6 鴨新城疫病毒檢測 新城疫是一種由新城疫病毒引起的急性、高度傳染性病，是禽類養(yǎng)殖中的重要疫病之一，在世界各地廣發(fā)流行，各日齡鴨均可感染新城疫病毒發(fā)病，雛鴨最為嚴重，死亡率可達100%，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失.鞠小軍等[17]選取鴨源新城疫病毒NP基因的相對保守區(qū)序列，利用Primer Explorer V4在線軟件設(shè)計了3對RT-LAMP引物，建立鴨源新城疫病毒RT-LAMP快速檢測方法。結(jié)果顯示，該法能夠在63℃下1h內(nèi)實現(xiàn)目標核酸區(qū)段的大量擴增，反應(yīng)結(jié)果可直接用肉眼判斷，特異性強，靈敏度高，與其他病毒，如H9N2亞型AIV、鴨呼腸孤病毒（DRV）、禽偏肺病毒、傳染性支氣管炎病毒等的核酸無交叉反應(yīng)，可檢測到1×10-3稀釋度的目標RNA（0.1pg/μl），較普通RT-PCR的靈敏性高10倍。

2.7 鴨圓環(huán)病毒檢測 鴨圓環(huán)病毒（DuCV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的病毒之一，2003年由德國學(xué)者 Hattermann等[18]首先發(fā)現(xiàn)并報道。鴨感染DuCV的主要臨床表現(xiàn)為生長遲緩、羽毛凌亂、體重減輕等癥狀，更重要的是可感染禽類的免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制[19-20]。趙光遠等[21]根據(jù)GenBank中DuCV基因序列，在保守區(qū)設(shè)計了6條特異性引物，并對反應(yīng)條件進行優(yōu)化，建立了一種適用于DuCV的LAMP檢測方法。該方法對H9亞型AIV、小鵝瘟、DPV、DHV、鴨副黏病毒均無擴增反應(yīng)，且擴增反應(yīng)只需在常規(guī)水浴鍋中進行，1h內(nèi)即可完成反應(yīng)，對DuCV模版DNA的最小檢測限為10fg，靈敏度是一步法PCR的1000倍。

2.8 鴨呼腸孤病毒檢測 引起鴨發(fā)病的呼腸孤病毒有新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）和番鴨呼腸孤病毒（MDRV），鴨感染后主要臨床表現(xiàn)為軟腳、腹瀉等，有的能夠引起高達98%的死亡率，病理變化則主要以肝、脾灰白色局灶性壞死為特征[22]。馬利等[23]建立了一種基于熒光顯色的禽呼腸孤病毒LAMP檢測方法。該檢測方法使用針對禽呼腸孤病毒的p10基因8個區(qū)域的6條LAMP引物，能夠在63℃恒溫條件下1h內(nèi)完成反應(yīng)，具有良好的敏感性和特異性，最低能夠檢出102個拷貝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而對其他病毒檢測結(jié)果為陰性。在熒光顯色中分別應(yīng)用SYBR GreenⅠ和鈣黃綠素作為顯色劑，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳一致。于可響等[24]建立適于基層實驗室快速檢測NDRV的一步RT-LAMP方法?；谛滦网喓裟c孤病毒S3基因的6個保守區(qū)域設(shè)計了4條LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒溫保持45min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)，由此建立了RT-LAMP檢測方法。該方法具有良好的特異性，除NDRV外對其他6種常見鴨病的檢測結(jié)果均為陰性。該方法對病毒RNA的最低檢出量為0.1pg，是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

3 在鴨細菌病檢測中的應(yīng)用

3.1 鴨疫里默氏桿菌檢測 鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌感染引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎、新鴨病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫巴氏桿菌病等。該病主要侵害鴨等水禽類動物，臨床表現(xiàn)主要為神經(jīng)癥狀、纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎，2～7周齡雛鴨受到的危害最嚴重，發(fā)病率可達90%以上，死亡率高達75%以上，給養(yǎng)鴨造成了嚴重的經(jīng)濟損失[25]。吳彤等[26]根據(jù)鴨疫里默氏菌16Sr RNA基因設(shè)計引物，在建立了檢測鴨疫里默氏菌的LAMP方法，該法在63℃ 60min即能完成反應(yīng)，通過監(jiān)測反應(yīng)液濁度判斷結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，用煮沸10min的方法代替試劑盒提取DNA方法，并用顯色方法代替濁度檢測和瓊脂糖凝電泳方法判斷結(jié)果，通過敏感性、特異性、病原消長規(guī)律試驗驗證方法的準確性。結(jié)果顯示，顯色法、濁度檢測和瓊脂糖凝電泳方法判斷結(jié)果的敏感性和特異性相同。細菌分離法共獲得201株鴨疫里默氏菌，且經(jīng)LAMP與PCR法檢測均呈陽性，LAMP與PCR法檢出陽性樣本總數(shù)分別為271份和254份，LAMP方法陽性檢出率高于PCR方法。

3.2 禽多殺性巴氏桿菌檢測 禽霍亂是一種由禽多殺性巴氏桿菌引起家禽和野禽發(fā)病死亡的接觸性傳染病，常表現(xiàn)為敗血型，發(fā)病率和死亡率都很高，但有時表現(xiàn)為慢性經(jīng)過。早在18世紀歐洲各地的禽類就常發(fā)生此病，目前該病在世界大多數(shù)國家都有分布，呈散發(fā)性或流行性，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，多年來一直都被國內(nèi)外學(xué)者所重視，被列為重點防治的家禽疫病之一。施少華等[27]以禽多殺性巴氏桿菌C48-1為研究對象，利用LAMP方法對Pm進行快速檢測，結(jié)果表明：LAMP方法在恒溫65℃下，1h內(nèi)就可以檢測到Pm，LAMP方法最低可檢測100pg.μl-1Pm基因組DNA。該方法不需要精密的溫度循環(huán)裝置，有恒溫加熱設(shè)備就可以滿足檢測條件，適合基層臨床應(yīng)用。

4 小結(jié)

LAMP技術(shù)作為一種快速基因擴增技術(shù)，自發(fā)明以來，在國內(nèi)外疾病、衛(wèi)生、食品及環(huán)境等多個領(lǐng)域都取得了重大成就，近年來受到了越來越多的關(guān)注，LAMP是整個過程均在恒溫條件下進行，不需要昂重儀器設(shè)備，而易在基層部門普及的檢測技術(shù)，避免了常規(guī)PCR對于溫度循環(huán)的特殊要求所帶來的各種不便，可快速、準確地做出傳染性病病原學(xué)診斷，從而及時有效控制疫情，使養(yǎng)殖場損失降到最低。但LAMP檢測技術(shù)同樣存在一些不足，一是LAMP對于引物設(shè)計要求很高，需要設(shè)計的引物數(shù)目多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜；二是檢測靈敏度太高，易因空氣中的氣溶膠污染而產(chǎn)生假陽性結(jié)果；三是在LAMP擴增結(jié)果判定方面也存在一定的問題，當(dāng)以瓊脂糖凝膠電泳法法判定結(jié)果時，結(jié)果為梯形條帶，不易鑒別非特異性擴增。當(dāng)焦磷酸鎂白色沉淀和體系中添加染料法判定結(jié)果時，可能存在因結(jié)果顏色不明顯而造成肉眼觀察不便捷及誤判，另外，當(dāng)有非特異擴增時，染料也可結(jié)合，影響結(jié)果判定。當(dāng)微流控芯片和實時濁度儀法判定結(jié)果時，則需要購置昂貴的分析儀器，隨著研究的不斷深入，研究人員還將其原位雜交、免疫捕獲、核酸雜交等技術(shù)進行聯(lián)合，開發(fā)了很多有效的檢測方法，尤其是將環(huán)介導(dǎo)橫溫擴增與橫向流動試紙條技術(shù)結(jié)合，發(fā)展起來的新的將環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）與橫向流動試紙條（LFD）聯(lián)合應(yīng)用，建立一種新的病原快速檢測技術(shù)，即LAMP-LFD技術(shù)。使得LAMP現(xiàn)場檢測結(jié)果的觀察更加方便、直觀和準確。并解決了擴增產(chǎn)物形成氣溶膠污染環(huán)境，導(dǎo)致樣品間交叉污染的問題，開啟了基因檢測技術(shù)步入了基層養(yǎng)殖場的應(yīng)用新時代，極具推廣前景。目前已經(jīng)有科研人員在CSFV的檢測方面[28]進行了一些探索，并取得了一定的成績，筆者認為這將是LAMP-LFD技術(shù)是未來LAMP檢測技術(shù)將來的發(fā)展的方向，在一些基層實驗室和流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻：

[1] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop- mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research，2000，28（12）：63.

[2] Nagamine K，Watanage K，Ohtsuka K，et al.Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template[J].Clin Chem，2001，47（9）：1742-1743.

[3] Mori Y，Nagamine K，Tmita N，et al.Detection of Loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magne？sium pyrophosphate formation[J].Bioch and Bioph ResCom，2001，289（1）：150-154.

[4] 謝麗基，謝芝勛，劉加波，等.鴨Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可視化檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（02）：112-115.

[5] 胡成，朱善元，左偉勇，等.鴨I型肝炎病毒一步法RT-LAMP可視化快速檢測方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31 （3）：613-618.

[6] 朱麗萍，顏世敢.鴨坦布蘇病毒研究進展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，34（1）：79-82.

[7] 張偉，逯茂洋，黃慶華，等.熒光顯色技術(shù)在鴨坦布蘇病毒LAMP檢測方法中的應(yīng)用及比較[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2014，44（04）：406-411.

[8] 董嘉文，孫敏華，李林林，等.實時熒光技術(shù)在鴨坦布蘇病毒RT-LAMP檢測方法中的應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（1）：109-112.

[9] 甘孟侯.中國禽病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999，109-119.

[10] 許宗麗，謝芝勛，郭捷，等.鴨瘟病毒LAMP可視化檢測方法的建立[J].生物技術(shù)通訊，2012，23（03）：426-429.

[11] 張坤，刁有祥，鞠小軍.鴨瘟病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）快速檢測方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（04）：520-525.

[12] Olsen B，Munster VJ，Wallensten A，et al.Global patterns ofinfluenza a virus in wild birds[J].Science，2006，312 （5772）：384-388.

[13] 王辰雨，胡敬東，史玉穎，等.禽流感病毒LAMP快速診斷方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，26（03）：576-580.

[14] 石霖，王秀榮，孫阮洋，等.禽流感病毒通用型RT-LAMP快速檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2015，37（05）：383-386.

[15] 劉文波，柴同杰.雛番鴨細小病毒研究進展[J].中國家禽，2001，2（313）：33-35.

[16] 謝麗基，謝芝勛，劉加波，等.番鴨細小病毒LAMP可視化檢測方法的建立[J].中國動物檢疫，2013，30（02）：46-48.

[17] 鞠小軍，刁有祥，唐熠，等.鴨源新城疫病毒RT-LAMP快速檢測方法的建立[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，39（12）：15-20.

[18] Hattermann K，Schmitt C，Soike D，et al.Cloning and sequencing of duck circoviru（sDuCV）[J].Arch Virol，2003，148（12）：2471-2480.

[19] Soike D，Kohler B，Albrecht K.A circovirus like infection in geese related to a runting syndrome[J].Av Pathol，1999，28（2）：199-202.

[20] Johne R，F(xiàn)ernández-de-Luco D， H？fle U，et al.Genome of a novel circovirus of starlings，ampli？ed by multiply primed rolling-circle ampli？cation[J].J Gen Virol，2006，87（5）：1189-1195.

[21] 趙光遠，謝芝勛，謝麗基，等.鴨圓環(huán)病毒LAMP可視化檢測方法的建立[J].中國動物檢疫，2012，29（03）：24-26.

[22] 胡奇林，陳少鶯，林鋒強，等.番鴨呼腸孤病毒的鑒定[J].病毒學(xué)報，2004，20（3）：242-248.

[23] 馬利，張琳，張秀美，等.基于熒光顯色的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（LAMP）檢測禽呼腸孤病毒[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2013，33（02）：166-170.

[24] 于可響，馬秀麗，韓宏宇，等.新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J].生物技術(shù)通報，2015，31（08）：71-75.

[25] BW卡爾尼克.禽病學(xué)[M].10版.高福，蘇敬良，譯.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：195-202.

[26] 吳彤，李旭妮，閆新博，等.鴨疫里默氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2016，36（08）：1-6.

[27] 施少華，陳紅梅，程龍飛，等.檢測禽多殺性巴氏桿菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）方法的建立[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，39（04）：388-391.

[28] 朱俊靈，葉佐東，鄧潔汝，等.鴨瘟病毒RT-LAMP-LFD檢測方法的建立與應(yīng)用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，37（01）：1-7.