原桃膠中1 株芽孢桿菌的分離鑒定及其主要抗菌物質(zhì)

賈 銳，陸兆新

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

原桃膠中1 株芽孢桿菌的分離鑒定及其主要抗菌物質(zhì)

賈 銳，陸兆新*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

從天然原桃膠分離到1 株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的芽孢桿菌TJ12。其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）有抑菌活性。結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)、16S rRNA序列和gyrB序列將TJ12菌株鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。通過(guò)硫銨沉淀、有機(jī)溶劑萃取、羥丙基葡聚糖凝膠、高效液相色譜分離純化，得到其主要活性物質(zhì)。該物質(zhì)對(duì)pH值、溫度和3 種蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）有較好的穩(wěn)定性。經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜分析，初步鑒定該株地衣芽孢桿菌TJ12的主要抗菌物質(zhì)為桿菌肽A。

原桃膠；地衣芽孢桿菌；抗菌物質(zhì)；分離純化；鑒定；桿菌肽A

抗菌肽（antimicrobial peptide）是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì)，它是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分?？咕木哂歇?dú)特殺菌機(jī)制和抗菌廣譜性，不易造成病原菌的耐藥性。一些抗菌肽對(duì)腫瘤細(xì)胞有廣譜殺滅活性效果，為癌癥患者提供了一類新型的抗癌藥物[1-2]，其在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[3]、飼料添加劑[4]、食品防腐劑[5]等方面也具有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前抗菌肽已經(jīng)成功應(yīng)用在馬鈴薯、煙草、水稻等的病蟲害防治中[6]。由于其在醫(yī)藥、養(yǎng)殖、食品、生物防治等方面有很高的應(yīng)用價(jià)值，抗菌肽的研究備受人們關(guān)注和青睞。

微生物來(lái)源的抗菌肽是抗菌肽家族中的重要一員，它能特異性殺死競(jìng)爭(zhēng)菌而對(duì)宿主本身無(wú)害，包括環(huán)形肽、糖肽和脂肽，如短桿菌肽、桿菌肽、多黏菌素和乳酸鏈球菌肽等[6]。其中芽孢桿菌（Bacillus spp.）是研究較多的抗菌肽產(chǎn)生菌，其在自然界分布非常廣泛，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)種群之一。目前研究較多的芽孢桿菌有：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、多黏芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）等[7-9]。

桃樹膠是桃樹樹干受機(jī)械創(chuàng)傷（如蟲咬、切傷等）或病菌感染致病后分泌出來(lái)的膠質(zhì)半透明物質(zhì)，有較好的保健功能[10-11]。原桃膠是在樹上自然風(fēng)干未經(jīng)除雜的桃膠。國(guó)內(nèi)外涉及桃膠的文獻(xiàn)多數(shù)是關(guān)于防治病蟲害、提高樹體抵抗力以減少桃膠分泌等方面[12]，鮮見(jiàn)桃膠中相關(guān)微生物及抗菌肽等抑菌活性物質(zhì)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從原桃膠中分離出一株具抑菌活性的芽孢桿菌，并對(duì)這株芽孢桿菌主要抗菌物質(zhì)進(jìn)行研究，以期為人們更深入地開(kāi)發(fā)、利用相關(guān)資源提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

芽孢桿菌TJ12系從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院桃樹林的原桃膠中分離得到。

指示細(xì)菌：藤黃微球菌（Mirococcus luteus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、大腸桿菌（Escherichia coli）；指示真菌：串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、黑曲霉（Aspergillus nige）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）。以上均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯浸汁培養(yǎng)基按照文獻(xiàn)[13-14]中的方法配制；糖發(fā)酵培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基等的配制均參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]。

菌株DNA提取試劑 上海生物工程有限公司；酵母提取物和胰化蛋白胨 英國(guó)Oxoid公司；革蘭氏染色試劑盒 杭州百思生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP 日本TaKaRa公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒美國(guó)Omega公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5804R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；PTC-100TM 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)MJ Research公司；全溫?fù)u瓶柜 太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；HT6029超凈工作臺(tái) 蘇州進(jìn)化設(shè)備有限公司；BL-220H電子精密天平 日本島津公司；Orion 3 STAR pH計(jì) 美國(guó)Thermo公司；Eclipse 80i光學(xué)顯微鏡 日本Nikon公司；UltiMate 3000反相高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)戴安公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 德國(guó)Bruker Daltonics公司；BS-100A自動(dòng)分布收集儀、HL-2B數(shù)顯恒流泵 上海滬西分析儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌的篩選

初篩：取10 g天然刮取的原桃膠，放入裝有100 mL生理鹽水的錐形瓶中，37 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)液80 ℃水浴處理20 min，制成一定稀釋梯度的菌懸液，分別取0.1 mL于LB平板涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h。分別將得到的單菌落采用無(wú)菌牙簽分散轉(zhuǎn)接于另一無(wú)菌LB平板，37 ℃條件下培養(yǎng)36 h。用無(wú)菌打孔器于生長(zhǎng)菌落旁取出5 mm直徑的瓊脂塊，貼放于含有指示菌的平板表面，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈大小。

復(fù)篩：將經(jīng)初篩得到的抑菌圈較大的菌株劃線，將單菌落接種液體LB培養(yǎng)基，37 ℃條件下180 r/min培養(yǎng)36 h。發(fā)酵液4 ℃、14 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，將除菌后的發(fā)酵上清液通過(guò)平板打孔法檢測(cè)抗菌物質(zhì)活性。

抑菌活性檢測(cè)：各取50 μL過(guò)膜除菌后的不同樣品加到5 mm的抑菌平板孔徑中，37 ℃培養(yǎng)12 h以上，根據(jù)抑菌圈的大小判斷供試菌株的抑菌活性。每個(gè)供試菌株設(shè)3 次重復(fù)。將得到的抑菌活性最好的菌株保藏菌種。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[15]及《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]對(duì)菌株TJ12進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、運(yùn)動(dòng)性分析及生理生化實(shí)驗(yàn)（生長(zhǎng)溫度、耐酸堿度、運(yùn)動(dòng)性、耐鹽性、接觸酶、淀粉水解、V.P、甲基紅、硝酸鹽還原、碳源利用、硫化氫）[15-20]。

1.2.2.2 基于16S rDNA和gyrB基因序列的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)抑菌活性較強(qiáng)、抗菌譜較廣的菌株進(jìn)行基因組DNA提取、16S rRNA基因及gyrB基因PCR擴(kuò)增，割膠回收，回收產(chǎn)物同pMD-19載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞DH5α，篩選得到的陽(yáng)性克隆由南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序所得16S rRNA序列及gyrB基因校對(duì)后，與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)序列同源性，選取不同的模式菌株，采用MEGA（Ver. 5.0）軟件的Neighbor-Joining phylogenetic tree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬關(guān)系[21-23]。

1.2.3 抗菌物質(zhì)分離純化[24-28]

1.2.3.1 硫酸銨分級(jí)沉淀[26,29]

分別采用飽和度20%～90%的硫酸銨梯度對(duì)發(fā)酵上清液（1.2.1節(jié)復(fù)篩步驟得到的上清液）進(jìn)行分級(jí)沉淀處理，沉淀離心，超純水復(fù)溶，以藤黃微球菌為指示菌，瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性[19]，確定最適硫酸銨分級(jí)沉淀?xiàng)l件。在合適條件下收集足量沉淀，超純水復(fù)溶，做進(jìn)一步純化處理。每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.2.3.2 有機(jī)溶劑萃取

分別用2 倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)抗菌物質(zhì)水溶液進(jìn)行萃取，選取最適有機(jī)溶劑。將最適有機(jī)溶劑下萃取得到的有機(jī)相45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，沉淀甲醇溶解，做進(jìn)一步純化處理。每個(gè)處理重復(fù)3 次[30]。

1.2.3.3 LH-20分離純化

將Sephadex LH-20充分溶脹后裝柱（1.6 cm× 120 cm），80%甲醇平衡2 個(gè)柱體積后，取1 mL甲醇復(fù)溶樣品進(jìn)行SephadexLH-20柱分離，研究最適分離條件。餾分收集后，以藤黃微球菌為指示菌，瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)其抑菌活性[30]。

1.2.4 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性研究

將經(jīng)LH-20純化后收集到的足量活性物質(zhì)旋蒸干燥后，超純水復(fù)溶作為樣品，探究其穩(wěn)定性。所有穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以藤黃微球菌作指示菌，瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)其抑菌活性，方法同復(fù)篩[26,31]。

1.2.4.1 pH值穩(wěn)定性

取5 mL樣品6 份，分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將其pH值調(diào)至2、4、6、8、10、12，室溫處理10 h，測(cè)活性前將pH值調(diào)回7，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照（CK），測(cè)試抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.2.4.2 熱穩(wěn)定性

處理1：取5 mL樣品5 份，分別于20、40、60、80、100 ℃水浴處理3 h，121 ℃條件下處理15 min，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照（CK），測(cè)試抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

處理2：取5 mL樣品5 份，分別于20、40、60、80、100 ℃水浴處理6 h，121 ℃條件下處理35 min，以未經(jīng)處理的樣品為對(duì)照（CK），測(cè)試抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.2.4.3 蛋白酶穩(wěn)定性

胰蛋白酶：首先用pH 8.0的磷酸緩沖液將胰蛋白酶配成質(zhì)量濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、2.80 mg/mL的酶液。取7 支刻度試管，每支試管中添加0.5 mL抗菌提取物，1～5號(hào)管中加入以上5 種不同質(zhì)量濃度酶液2 mL。6號(hào)管（CK1）不加酶液，僅加入2 mL磷酸緩沖液，作為抗菌物質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶處理后活性是否發(fā)生變化的參照。1～6號(hào)管置37 ℃水浴6 h，100 ℃條件下水浴3 min終止酶活。7號(hào)管（CK2）不加酶液和緩沖液pH值調(diào)到8.0。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

蛋白酶K：處理方法與胰蛋白酶相同，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

胃蛋白酶：胃蛋白酶用pH 2.0磷酸緩沖液配制，1～5號(hào)管中加入的胃蛋白酶質(zhì)量濃度依次為50、100、150、200、250 μg/mL，6號(hào)管（CK1）中僅加入緩沖液。1～6號(hào)管經(jīng)過(guò)水浴處理、終止酶活性后，需將pH值調(diào)回7.0。7號(hào)管（CK2）不進(jìn)行任何處理，其他處理方法與胰蛋白酶相同。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 活性物質(zhì)全波長(zhǎng)掃描、反相HPLC法檢測(cè)及電噴霧離子化質(zhì)譜（electrospray ionization-mass spectrometry ESI-MS）分析[32-34]

將LH-20收集的活性組分用UV-2450分光光度計(jì)于190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以確定其特征吸收峰并作為反相HPLC法的檢測(cè)波長(zhǎng)。反相HPLC條件為：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm）；進(jìn)樣量20 μL；柱溫35 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速0.8 mL/min；檢測(cè)時(shí)間50 min；流動(dòng)相A相為水-0.1%三氟乙酸，B相為乙腈-0.1%三氟乙酸（按10 min：15% A，85% B；30 min：30% A，70% B；50 min：50% A，50% B程序分離）。樣品和流動(dòng)相在上柱前都經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾。收集經(jīng)反相HPLC分離得到的各個(gè)峰，于臺(tái)式快速離心濃縮干燥器上濃縮后以藤黃微球菌為指示菌測(cè)定各個(gè)峰的抑菌活性。收集主要活性物質(zhì)，再次用反相HPLC檢測(cè)活性物質(zhì)純度，以確保樣品的純度適合進(jìn)行ESI-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

經(jīng)過(guò)初篩與復(fù)篩，得到一株抑菌譜較廣的菌株TJ12，其發(fā)酵上清液對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果較好，對(duì)部分真菌有一定的抑菌效果（表1）。

表1 菌株TJ12發(fā)酵液對(duì)指示菌抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of the fermentation broth from strain TJ12

由圖1可知，菌株TJ12發(fā)酵上清液對(duì)藤黃微球菌抑菌效果較好，對(duì)金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌有一定抑菌效果，但對(duì)大腸桿菌無(wú)明顯抑菌效果。發(fā)酵上清300 倍濃縮液對(duì)串珠鐮刀菌有較好的抑菌活性，對(duì)黑曲霉和葡枝根霉抑菌效果不明顯，對(duì)釀酒酵母無(wú)明顯抑菌效果。說(shuō)明菌株TJ12對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果較明顯，對(duì)部分真菌有一定抑菌效果。

圖1 菌株TJ12發(fā)酵液對(duì)指示菌抑菌作用Fig. 1 Photographs showing the antibacterial activity of the fermentation broth from strain TJ12

2.2 菌株TJ12的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

菌體短桿狀、革蘭氏染色陽(yáng)性、芽孢中生、菌落米黃色（圖2未顯示）、飽滿凸起、表面濕潤(rùn)有光澤，菌落形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)變化，早期菌落邊緣光滑整齊，12 h后菌落四周邊沿逐漸出現(xiàn)凸起，含大量透明黏液，48 h后菌落中間皺起，邊緣仍存在光滑飽滿黏液泡（圖2）。

圖2 菌株TJ12的培養(yǎng)特征Fig. 2 Cultural characteristics of strain TJ12

2.2.2 生理生化特征

表2 菌株TJ12生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain TJ12

菌株TJ12具有運(yùn)動(dòng)性；接觸酶反應(yīng)、V.P實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、甲基紅實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性；菌株能分解利用大部分碳源，其中α-乳糖、山梨醇、肌醇利用速率較慢（大于5 d觀察到陽(yáng)性結(jié)果），但不能利用鼠李糖、棉子糖；其耐鹽性為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0～10% NaCl范圍，但質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%時(shí)菌體生長(zhǎng)很緩慢；其生長(zhǎng)pH值范圍為5～9；生長(zhǎng)適應(yīng)溫度范圍為28～50 ℃（表2）。

綜合以上培養(yǎng)特征及生理生化特征，并根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，初步將TJ12菌株鑒定為芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[15-16]。

2.2.3 16S rRNA、gyrB序列分析

圖3 以16S rRNA（A）和gyrB（B）序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic relationship based on 16SrRNA (A) and gyrB (B) sequences

16S rRNA序列測(cè)序后采用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST比對(duì)，菌株TJ12的16S rRNA序列與GenBank中的空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）、索諾拉沙漠芽孢桿菌（Bacillus sonorensis）及地衣芽孢桿菌16S rRNA序列相似性均達(dá)99%。再通過(guò)gyrB序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，菌株TJ12的gyrB基因與數(shù)據(jù)庫(kù)中地衣芽孢桿菌相似度達(dá)到100%（圖3）。

綜合TJ12菌株的生理生化特征、形態(tài)學(xué)特征、16S rRNA和gyrB基因序列同源性分析結(jié)果，將菌株TJ12鑒定為地衣芽孢桿菌[15-16,35-39]。

2.3 抑菌活性物質(zhì)分離純化及鑒定

2.3.1 硫酸銨分級(jí)鹽析

當(dāng)硫酸銨飽和度在20%～90%之間時(shí)，沉淀溶解液均存在抑菌活性；飽和度達(dá)到70%時(shí)，沉淀溶解液的活性達(dá)到最大，但上清液中仍含有較多活性物質(zhì)；當(dāng)飽和度達(dá)到80%～90%時(shí)，上清液中殘留的活性物質(zhì)已較少且降低幅度變緩。硫酸銨飽和度小于20%時(shí)沉淀中存在較多雜蛋白，鹽濃度過(guò)高對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成不便，參照文獻(xiàn)[28]選擇在20%～80%硫酸銨飽和度下沉淀析出的抑菌活性物質(zhì)作進(jìn)一步純化處理（圖4）。

圖4 不同飽和度硫酸銨沉淀抑菌活性Fig. 4 Antimicrobial activity of precipitates with different saturation degrees of ammonium sulfate

2.3.2 有機(jī)溶劑萃取

表3 不同有機(jī)溶劑萃取相抑菌效果Table 3 Antimicrobial activity of extraction phases of different organic solvents

3 種有機(jī)溶劑極性依次為石油醚＜乙酸乙酯＜正丁醇，石油醚、乙酸乙酯均不能有效地提取抗菌物質(zhì)，而正丁醇能將活性物質(zhì)完全萃取，說(shuō)明該活性物質(zhì)為極性物質(zhì)（表3）。故選取正丁醇作為有效的萃取試劑。

2.3.3 Sephadex LH-20分離純化

圖5 Sephadex LH-20分離抗菌物質(zhì)Fig. 5 Purification of the antimicrobial substance by Sephadex LH-20 column chromatography

65 份組分中，第22～25管組分有抑菌活性，24管組分的抑菌活性最高（圖5）。收集足量22～25管組分濃縮。以超純水復(fù)溶樣品探究物質(zhì)穩(wěn)定性；甲醇復(fù)溶樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并在最大吸收波長(zhǎng)下研究反相HPLC分析條件以進(jìn)行純度檢測(cè)。

2.4 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性

圖6 菌株TJ12抗菌物質(zhì)的pH值（A）、溫度（B）和蛋白酶（C）穩(wěn)定性Fig. 6 Stability of the antimicrobial substance produced by TJ12

菌株TJ12抗菌物質(zhì)在經(jīng)過(guò)pH 2～12處理10 h都有抑菌活性，說(shuō)明該抗菌物質(zhì)的pH值穩(wěn)定性較好。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pH 2～4的條件下溶液會(huì)出現(xiàn)少量沉淀，而pH 6～10環(huán)境下，物質(zhì)能完全溶解，說(shuō)明該物質(zhì)pH值穩(wěn)定性較好，但偏中性或堿性環(huán)境下溶解性更好（圖6A）。該物質(zhì)在低于100 ℃條件下處理6 h，抑菌活性都比較穩(wěn)定，沸水浴中處理6 h后活性僅略有降低，121 ℃處理35 min后才能徹底失活。說(shuō)明該物質(zhì)具有較好的溫度穩(wěn)定性（圖6B）?？咕镔|(zhì)隨著胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶質(zhì)量濃度的增加，處理6 h后的抗菌物質(zhì)活性基本沒(méi)有變化，說(shuō)明該物質(zhì)有較好的蛋白酶穩(wěn)定性（圖6C）。綜上，菌株TJ12主要抗菌物質(zhì)具有較好的穩(wěn)定性，為其實(shí)際應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

2.5 活性物質(zhì)全波長(zhǎng)掃描

抑菌活性物質(zhì)在約210 nm和255 nm波長(zhǎng)處都有吸收波長(zhǎng)，其中210 nm為最大吸收波長(zhǎng)（圖7），選擇以210 nm作為反相HPLC檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖7 TJ12抗菌物質(zhì)全波長(zhǎng)掃描圖譜Fig. 7 Full-wavelength scanning spectrum of the antimicrobial substance from TJ12

2.6 反相HPLC檢測(cè)與分離

經(jīng)Sephadex LH-20分離后，在210 nm波長(zhǎng)處按1.2.5節(jié)方法進(jìn)行反相HPLC分離檢測(cè)。經(jīng)抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其主要活性峰為峰1（圖8），通過(guò)反相HPLC分離收集足量活性單峰1，濃縮后用于質(zhì)譜分析。

圖8 反相HPLC檢測(cè)抗菌物質(zhì)Fig. 8 RT-HPLC separation of the antifungal substance produced by TJ12

2.7 活性物質(zhì)ESI-MS鑒定

多數(shù)多肽類化合物帶有多電荷，電荷數(shù)和豐度常不穩(wěn)定，質(zhì)譜將其碎裂后得到的可能是帶有2 個(gè)或者更多電荷的離子。圖9為TJ12主要抑菌活性物質(zhì)ESI-MS圖，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，將TJ12主要抑菌活性物質(zhì)鑒定為桿菌肽A（相對(duì)分子質(zhì)量1 422）[40-42]，圖譜中還可以看到出自于桿菌肽A帶3 個(gè)正電荷的分子離子峰m/z 475和帶2 個(gè)正電荷的分子離子峰m/z 712，其中帶兩個(gè)正電荷的分子離子峰豐度較強(qiáng)[43-44]。桿菌肽屬多肽類抗生素，由地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生，是由12 個(gè)氨基酸組成含有噻唑環(huán)的多肽復(fù)合體，它是多種氨基酸結(jié)合而成的多肽，桿菌肽A是其最主要的成分[42]。桿菌肽由于其高效、無(wú)毒副作用、無(wú)殘留、不產(chǎn)生交叉耐藥性及抗藥性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，其在飼料添加劑方面也有廣泛的應(yīng)用前景[45-46]。

圖9 菌株TJ12抗菌物質(zhì)的ESI-MS 圖Fig. 9 ESI mass spectra of the antimicrobial substance produced by TJ12

3 討 論

利用細(xì)菌、真菌分泌的抗菌物質(zhì)，尤其是肽類物質(zhì)，研制的抗菌藥物，為醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供無(wú)殘留、無(wú)環(huán)境污染、不產(chǎn)生耐藥性問(wèn)題的新一代抗菌藥物，是現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。但目前人們對(duì)其原材料尤其是相關(guān)微生物的抑菌活性成分沒(méi)有研究。

本研究從天然桃樹上刮取原桃膠作為研究對(duì)象，篩選分離得到菌株TJ12，其發(fā)酵上清液對(duì)藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌，以及串珠鐮刀菌等真菌具有抑菌效果，但對(duì)革蘭氏陰性菌幾乎沒(méi)有抑菌效果。用傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)分類方法對(duì)菌株TJ12的特性進(jìn)行鑒別，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rRNA基因序列和gyrB基因序列分析，菌株TJ12被鑒定為地衣芽孢桿菌。該株菌培養(yǎng)過(guò)程中，固體平板上形態(tài)特別，菌落四周產(chǎn)生大量黏稠泡狀突起，液體發(fā)酵液極度黏稠，推測(cè)其生長(zhǎng)過(guò)程中分泌大量糖類物質(zhì)，不確定此生理特征與其所生長(zhǎng)的桃樹膠環(huán)境是否相關(guān)。對(duì)地衣芽孢桿菌胞外多糖功能有過(guò)初步報(bào)道，但研究尚不成熟，鑒于多糖具有抗氧化、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、抵抗有害菌、促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的作用，從而使機(jī)體增強(qiáng)抗腫瘤、抗衰老等能力，該株桃樹膠來(lái)源的地衣芽孢桿菌TJ12具備多糖方向的研究潛力[47-48]。

TJ12菌株在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，能夠分泌抗菌物質(zhì)。硫酸銨分級(jí)沉淀研究表明，20%～80%硫酸銨飽和度下析出的活性物質(zhì)可用作進(jìn)一步萃取處理。通過(guò)有機(jī)溶劑萃取實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，極性較大的正丁醇萃取效果較好。用Sephadex LH-20進(jìn)一步分離純化出抑菌活性物質(zhì)，檢測(cè)其在210 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)。

抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)研究中，所設(shè)置的pH值和溫度范圍較廣，在pH 2～10范圍內(nèi)仍保持較好的穩(wěn)定性，120 ℃條件下處理35 min才能徹底失活。同時(shí)對(duì)蛋白酶設(shè)置較寬的作用濃度范圍，分別通過(guò)3 種不同蛋白酶（胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶）的處理，抗菌物質(zhì)活性幾乎沒(méi)有變化。說(shuō)明該物質(zhì)具備較好的穩(wěn)定性。

最終通過(guò)反相HPLC分離純化、ESI-MS分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，推測(cè)其主要活性物質(zhì)為桿菌肽A，其相對(duì)分子質(zhì)量為1 422，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果較好。研究表明，桿菌肽為一種多肽類抗生素，可特異地抑制細(xì)菌胞壁合成階段的脫磷酸化作用，影響磷脂的轉(zhuǎn)運(yùn)和向細(xì)胞壁支架輸送黏肽，抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，并損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致離子和氨基酸外流而使細(xì)菌死亡[42]。桿菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌有強(qiáng)大的抑菌活性，對(duì)某些革蘭氏陰性球菌、放線菌和真菌有一定的活性[42,49-50]。

本研究為進(jìn)一步利用原桃膠這種資源奠定了一定理論基礎(chǔ)。該菌株的代謝產(chǎn)物及其抗菌物質(zhì)有望在疾病治療、生物防治、飼料防腐等領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用，是一株有應(yīng)用價(jià)值的抗菌物質(zhì)產(chǎn)生菌。同時(shí)該菌株的篩選、鑒定、物質(zhì)分離方法也為相關(guān)物質(zhì)的研究提供一定的參考。

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Isolation and Identification of a Bacillus from Peach Tree Gum and Its Main Antimicrobial Substance

JIA Rui, LU Zhaoxin*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A strain of Bacillus named as TJ12 was isolated from peach tree gum, which could produce antibacterial substances. Its fermentation products had antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus cereus and Fusarium moniliforme. Through colony morphology, physiological and biochemical characterization and 16S rRNA and gyrB sequence analysis, the strain was identified as Bacillus licheniformis. The major bioactive substance was separated from its fermentation supernatant and purified by ammonium sulfate precipitation, organic solvent extraction, Sephadex LH-20 column chromatography and high performance liquid chromatography. The major bioactive substance had strong resistance to pH, temperature, and three proteases (trypsin, proteinase K, and pepsin). By electrospray ionization-mass spectrometry analysis, we preliminarily identified this substance as bacitracin A.

peach tree gum; Bacillus licheniformis; antimicrobial substances; separation and purification; identification; bacitracin A

10.7506/spkx1002-6630-201621024

TS201.3

A

1002-6630（2016）21-0136-08

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JIA Rui, LU Zhaoxin. Isolation and identification of a Bacillus from peach tree gum and its main antimicrobial substance[J]. Food Science, 2016, 37(21): 136-143. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621024. http://www.spkx.net.cn

2016-01-02

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271936）

賈銳（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程。E-mail：13776618980@163.com

*通信作者：陸兆新（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：fmb@njau.edu.cn