桑葉經(jīng)霜前后總黃酮積累量與苯丙氨酸解氨酶活力及氣溫相關(guān)性分析

于小鳳，李韻竹，張魏琬麒，王篤軍，魏 淵，歐陽(yáng)臻,*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)京江學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

桑葉經(jīng)霜前后總黃酮積累量與苯丙氨酸解氨酶活力及氣溫相關(guān)性分析

于小鳳1,2，李韻竹3，張魏琬麒2，王篤軍2，魏 淵2，歐陽(yáng)臻2,*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)京江學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

為研究經(jīng)霜對(duì)桑葉總黃酮積累量影響的機(jī)制，分析桑葉經(jīng)霜前后總黃酮積累量合成關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活力的動(dòng)態(tài)變化，并對(duì)總黃酮積累量及氣候溫度進(jìn)行相關(guān)性分析。在6 mL pH 8.8、0.1 mol/L硼砂-鹽酸緩沖液中加入0.2 g桑葉葉片、0.2 g聚乙烯吡咯烷酮，底物L(fēng)-苯丙氨酸濃度為0.04 mol/L，40 ℃條件下水浴反應(yīng)40 min后測(cè)定經(jīng)霜前后桑葉PAL活力，采用紫外分光光度法測(cè)定經(jīng)霜前后桑葉總黃酮積累量。結(jié)果表明：PAL活力與平均氣溫呈極顯著負(fù)相關(guān)，與總黃酮積累量呈極顯著正相關(guān)，較低的溫度有利于黃酮類物質(zhì)的積累。

桑葉；苯丙氨酸解氨酶；經(jīng)霜；氣溫；總黃酮積累量

桑葉為桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥葉，藥用歷史悠久；味苦、甘，性寒，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目的功能，主要用于治療風(fēng)熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭痛、目赤昏花等[1]。桑葉營(yíng)養(yǎng)豐富，被我國(guó)衛(wèi)生部列入“既是食品又是藥品”名單，在功能性食品領(lǐng)域研究開(kāi)發(fā)中也具有廣闊前景[2]。中醫(yī)歷來(lái)認(rèn)為霜桑葉具有上乘品質(zhì)，古代眾多醫(yī)藥典籍中采用的桑葉也多為經(jīng)霜后采收（霜桑葉），歷版《中國(guó)藥典》中收錄的桑葉藥材也為“霜桑葉”。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)霜后桑葉中總黃酮積累量變高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)氣候溫度與總黃酮積累量呈極顯著負(fù)相關(guān)[3]?？傸S酮為桑葉主要活性成分之一[4-7]，具有消炎、抗菌作用。相關(guān)研究表明較低的溫度有利于黃酮類物質(zhì)的積累，主要原因是低溫可以使總黃酮合成途徑中相關(guān)酶的活力提高[8-9]。苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）為生合成途徑參與黃酮類物質(zhì)合成的第1個(gè)關(guān)鍵酶[10-13]。因此本課題組選取PAL關(guān)鍵酶，優(yōu)選了桑葉中PAL活力測(cè)定條件，分析桑葉經(jīng)霜前后PAL活力動(dòng)態(tài)變化，并研究經(jīng)霜前后PAL活力的變化與氣候溫度和總黃酮積累量之間的相關(guān)性，為闡明經(jīng)霜對(duì)桑葉黃酮類活性成分影響的分子機(jī)制提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉：2015年4—12月采自江蘇大學(xué)桑樹(shù)種植園，取頂端幼葉1～3 片。經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽(yáng)臻教授鑒定為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的葉。鮮桑葉液氮速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，用于PAL活力測(cè)定。同時(shí)陰干桑葉，粉碎，過(guò)20目篩用于總黃酮積累量測(cè)定。

對(duì)照品蘆?。?00080-200707） 中國(guó)食品藥品檢定研究院；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AE240分析天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HHS-1恒溫水浴鍋 上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠；ZF超聲波清洗機(jī) 上海致豐科技有限公司；Beckman冷凍離心機(jī) 北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司；超低溫冰箱上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 PAL活力測(cè)定及條件優(yōu)化

1.3.1.1 PAL活力測(cè)定

PAL活力測(cè)定方法參照陳雷等[14]方法并適當(dāng)修改。稱取桑葉葉片0.2 g，加入0.05 mol/L pH 8.8的硼砂-鹽酸緩沖液（含巰基乙醇5 mmol/L）6 mL，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）0.2 g，在冰浴中研磨勻漿，勻漿液于4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min。取0.2 mL上清液、0.02 mol/L 1 mL苯丙氨酸、0.05 mol/L 3.8 mL硼砂-鹽酸緩沖液檢測(cè)PAL活力。對(duì)照組不加苯丙氨酸只加0.2 mL上清液、4.8 mL硼砂-鹽酸緩沖液?；靹蚝笾?0 ℃恒溫水浴中靜置30 min，加入6 mol/L 0.5 mL鹽酸溶液終止反應(yīng)。在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度（A290nm），以每小時(shí)A290nm值變化0.1為一個(gè)酶活力單位（U），按下式計(jì)算PAL活力。

式中：VT為反應(yīng)液的總體積/mL；Vt為提取上清液（粗酶液）的體積/mL；Vs為測(cè)定時(shí)粗酶液的用量/mL；m為樣品的質(zhì)量/g；t為反應(yīng)時(shí)間/h。

1.3.1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化PAL活力測(cè)定條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以PAL活力為響應(yīng)值，對(duì)影響PAL活力的底物濃度、水浴時(shí)間、水浴溫度進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，確定測(cè)定經(jīng)霜前后桑葉樣品PAL活力的最佳條件。

1.3.2 桑葉總黃酮積累量測(cè)定

1.3.2.1 蘆丁對(duì)照品溶液的制備

精密稱取105 ℃干燥至恒質(zhì)量的蘆丁對(duì)照品12.9 mg，加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解，定容至50 mL，得質(zhì)量濃度為258 μg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，備用。

1.3.2.2 樣品溶液的制備

稱取桑葉藥材粉末1.0 g，加20 倍生藥量的70%乙醇溶液，85 ℃回流提取2 次，每次2 h。合并2次提取液，過(guò)濾，濾液定容至50 mL容量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，得樣品溶液，備用。

1.3.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取對(duì)照組溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL容量瓶，分別加入0.3 mL 5 g/100 mLNaNO2溶液后搖勻放置6 min，再加入0.3 mL 10 g/100 mL Al(NO3)3溶液后搖勻放置6 min，4 mL 4 g/100 mL NaOH溶液后搖勻放置15 min，最后用70%乙醇溶液定容至刻度，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁對(duì)照組質(zhì)量濃度x對(duì)吸光度y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.011 3x-0.001 1，R2＝0.999 9。結(jié)果表明，在12.9～103.2 μg/mL之間蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

1.3.2.4 桑葉總黃酮積累量測(cè)定[15]

取23 批次桑葉樣品，按1.3.2.2節(jié)方法制備樣品溶液，測(cè)定其吸光度，并計(jì)算桑葉中總黃酮積累量。

1.3.3 經(jīng)霜前后桑葉PAL活力的動(dòng)態(tài)變化與平均氣溫的相關(guān)性分析

以經(jīng)霜前后對(duì)應(yīng)日期的平均氣溫作圖，得到不同日期平均氣溫的變化趨勢(shì)圖。采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行PAL活力與平均氣溫的相關(guān)性分析，考察氣候溫度對(duì)桑葉PAL活力的影響。

1.3.4 經(jīng)霜前后桑葉PAL活力的動(dòng)態(tài)變化與總黃酮積累量相關(guān)性分析

采用SPSS 20.0 軟件分析桑葉經(jīng)霜前后PAL活力與總黃酮積累量的相關(guān)性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

桑葉PAL活力測(cè)定和總黃酮積累量測(cè)定實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以±s表示。正交試驗(yàn)方差分析采用Excel 2010軟件，相關(guān)性分析采用SPSS 20.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)霜前后桑葉PAL活力測(cè)定及條件優(yōu)化

2.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal with experimental

表2 正交試驗(yàn)方差分析Table 2 Analysis of variance of the orthogonal array design

由表1可知：RA＞RC＞RB，各因素對(duì)桑葉PAL活力影響大小依次為：底物濃度＞水浴溫度＞水浴時(shí)間。此結(jié)果與表2的方差分析結(jié)果一致。底物濃度和水浴溫度對(duì)桑葉PAL活力影響極顯著（P＜0.01）；水浴時(shí)間影響不顯著。故根據(jù)表1中k值可以得到PAL活力最佳測(cè)定件為A2B2C2。

按以上A2B2C2條件做3 次平行實(shí)驗(yàn)，桑葉PAL活力為142.26 U/g，表明該優(yōu)化試驗(yàn)方案可行。故最終確定桑葉PAL活力測(cè)定條件為：固定pH 8.8、0.05 mol/L的硼砂-鹽酸緩沖液為提取液，加入0.2 g/6 mL的PVP，底物L(fēng)-苯丙氨酸濃度為0.04 mol/L，水浴溫度為40 ℃，水浴時(shí)間為40 min。

2.1.2 經(jīng)霜前后桑葉PAL活力和總黃酮積累量

表3 經(jīng)霜前后桑葉PAL活力和總黃酮積累量Table 3 PAL activity and total flavonoid content in mulberry leaves harvested before and after frost

由表3可知，不同生產(chǎn)季節(jié)的23 批桑葉PAL活力處于動(dòng)態(tài)變化中。桑葉PAL活力在2015年4—5月份較高，之后隨氣溫升高有所下降，到8月份活力達(dá)到最低。9月份后PAL活力逐漸上升，特別是霜降（10月23日）后桑葉PAL活力增加明顯。桑葉中總黃酮積累量與生長(zhǎng)季節(jié)有關(guān)，4月份積累量較高，5月份之后積累量逐漸降低，8月份積累量達(dá)到最低，9月份之后積累量又逐漸升高，11月15號(hào)總黃酮積累量達(dá)到最高值，為43.5 mg/g。

2.2 桑葉經(jīng)霜前后PAL活力的動(dòng)態(tài)變化與氣候溫度的相關(guān)性分析

圖1 經(jīng)霜前后桑葉PAL活力及平均氣溫變化Fig. 1 Changes in PAL activity in mulberry leaves and average temperature before and after frost

由圖1可知，在溫度較低的4—5月份PAL活力較高，隨著氣溫的升高，PAL活力降低。溫度最高的8月份PAL活力降到最低。隨后溫度逐漸下降，PAL活力逐步上升。

PAL活力與平均溫度呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.614。推測(cè)經(jīng)霜前后環(huán)境溫度變化影響PAL活力，較低的平均氣溫有利于PAL活力的增加。

2.3 桑葉經(jīng)霜前后PAL活力的動(dòng)態(tài)變化與總黃酮積累量相關(guān)性分析

圖2 經(jīng)霜前后桑葉PAL活力及總黃酮積累量變化圖Fig. 2 Changes in PAL activity and total flavonoid content in mulberry leaves before and after frost

由圖2可知，經(jīng)霜前后桑葉PAL活力和總黃酮積累量變化趨勢(shì)基本一致。4—5月份時(shí)PAL活力較高，總黃酮積累量也高；5月份之后PAL活力逐漸降低，8月達(dá)到最低，總黃酮積累量也逐漸下降至8月份達(dá)到最低；9月份后PAL活力又逐漸上升，總黃酮積累量也同樣上升。

PAL活力與總黃酮積累量呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.660（P＜0.01）。該分析結(jié)果表明，在桑葉黃酮類化合物的生物合成途徑中PAL是合成關(guān)鍵酶，PAL活力的增加可以促使桑葉中黃酮類物質(zhì)增加。

3 討 論

桑葉為疏散風(fēng)熱、清肺潤(rùn)燥、清肝明目的常用中藥，藥用以采收于初霜后為佳。有研究表明桑葉中總黃酮積累量在霜降后會(huì)繼續(xù)上升[16-18]。本課題組前期研究了桑葉經(jīng)霜前后次生代謝產(chǎn)物的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)桑葉經(jīng)霜后黃酮類物質(zhì)積累量顯著升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)氣候溫度與總黃酮積累量呈極顯著負(fù)相關(guān)[3]。且相關(guān)研究也表明較低的平均溫度有利于黃酮類物質(zhì)的積累，主要原因可能是低溫可以使總黃酮合成途徑中相關(guān)酶的活力大幅度提高[8-9]。

PAL是參與桑葉生合成途徑中黃酮類物質(zhì)形成的第1個(gè)關(guān)鍵酶，且PAL是一種誘導(dǎo)酶，受多種外界因素的誘導(dǎo)。各種類型的低溫[19-20]、機(jī)械損傷[21]、CO2[22]等都可以誘導(dǎo)PAL基因的表達(dá)，影響其活力。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了桑葉PAL活力測(cè)定條件，采用6 mL pH 8.8、0.1 mol/L的硼砂-鹽酸緩沖液，加入0.2 g桑葉葉片、0.2 g PVP，底物L(fēng)-苯丙氨酸濃度為0.04 mol/L、40 ℃條件下水浴反應(yīng)40 min。采用優(yōu)化PAL活力測(cè)定條件分析了不同生長(zhǎng)季節(jié)及經(jīng)霜前后桑葉PAL活力的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)果表明不同生長(zhǎng)季節(jié)桑葉中PAL活力在4—5月份較高，之后隨氣溫升高有所下降，到8月份活力達(dá)到最低。9月份后隨氣溫下降，PAL活力逐漸上升，特別是霜降節(jié)氣（霜降10月23日）后桑葉PAL活力增加明顯。

對(duì)不同生長(zhǎng)季節(jié)及經(jīng)霜前后桑葉PAL活力的動(dòng)態(tài)變化與總黃酮積累量及氣候溫度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，不同季節(jié)桑葉中PAL活力與氣溫呈極顯著負(fù)相關(guān)，與總黃酮積累量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。桑葉經(jīng)霜前后主要是環(huán)境溫度發(fā)生變化，溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要影響因素之一[23-24]。外界溫度的改變，將影響植物細(xì)胞內(nèi)脅迫蛋白的表達(dá)，尤其是調(diào)控包括碳水化合物的生物合成與代謝在內(nèi)的能量代謝途徑，調(diào)整自身的生理狀態(tài)以適應(yīng)環(huán)境[25]。本課題組研究結(jié)果證實(shí)低溫可以誘導(dǎo)桑葉生合成途徑中PAL活力，有利于黃酮類物質(zhì)的積累。經(jīng)霜對(duì)桑葉生合成途徑黃酮類功效物質(zhì)和其他相關(guān)酶活力及基因表達(dá)的影響正在進(jìn)一步研究之中，為從植物生源途徑闡明經(jīng)霜過(guò)程對(duì)桑葉功效物質(zhì)影響的科學(xué)內(nèi)涵提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Mulberry Leaves Harvested before and after Frost: Correlation between Phenylalanine Ammonia Lyase Activity and Total Flavonoid Content as well as Air Temperature

YU Xiaofeng1,2, LI Yunzhu3, ZHANG Weiwanqi2, WANG Dujun2, WEI Yuan2, OUYANG Zhen2,*
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 2. School of Pharmacy, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China; 3. Jingjiang College, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In order to explore the mechanism underlying the influence of frost on the total flavonoid content in mulberry leaves, the dynamic changes in phenylalnine ammonia lyase (PAL) activity as a key enzyme in the biosynthesis of flavonoids was analyzed in mulberry leaves harvested before and after frost as well as the correlation between PAL activity and total flavonoid content or air temperature. For the determination of PAL activity in mulberry leaves, 0.2 g mulberry leaf powder was homogenized with 0.1 mol/L borax hydrochloric acid buffer (6 mL, pH 8.8) added with 0.2 g of polyethylene (PVP) and centrifuged, and the supernatant was allowed to react with 0.04 mol/L L-phenylalanine as substrate at 40 ℃for 40 min. At the same time, the total flavonoid content of mulberry leaves was measured by UV spectrophotometry. The results showed that PAL activity in mulberry leaves harvested after frost was higher than in those harvested before frost. PAL activity showed a very significantly negative correlation with temperature, whereas it was significantly positively correlated with total flavonoid content. Lower temperature had a significant positive effect on the accumulation of total flavonoids.

mulberry leaves; phenylalanine ammonialyase; frost; temperature; total flavonoids content

10.7506/spkx1002-6630-201621004

R932

A

1002-6630（2016）21-0021-05

于小鳳, 李韻竹, 張魏琬麒, 等. 桑葉經(jīng)霜前后總黃酮積累量與苯丙氨酸解氨酶活力及氣溫相關(guān)性分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(21): 21-25. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621004. http://www.spkx.net.cn

YU Xiaofeng, LI Yunzhu, ZHANG Weiwanqi, et al. Mulberry leaves harvested before and after frost: correlation between phenylalanine ammonia lyase activity and total flavonoid content as well as air temperature[J]. Food Science, 2016, 37(21): 21-25. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621004. http://www.spkx.net.cn

2015-12-08

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81072985；81373480；81573529）；江蘇大學(xué)第14批大學(xué)生科研立項(xiàng)一般項(xiàng)目（14A045）

于小鳳（1979—），女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓钚猿煞帧-mail：coler@ujs.edu.cn

*通信作者：歐陽(yáng)臻（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源活性成分及新藥開(kāi)發(fā)。E-mail：zhenouyang@ujs.edu.cn