免疫磁珠富集與熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒

曹姍姍　張文玲　王瑾　周魯林　劉留　吳燕　肖利力*

（1.北京國際旅行衛(wèi)生保健中心　北京　100088；2.重慶大學(xué)）

免疫磁珠富集與熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒

曹姍姍1張文玲1王瑾1周魯林1劉留2吳燕2肖利力1*

（1.北京國際旅行衛(wèi)生保健中心北京100088；2.重慶大學(xué)）

建立一種免疫磁珠與熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒的方法。將丙型肝炎病毒抗體與羧基修飾磁珠偶聯(lián)，制備出特異性丙型肝炎病毒免疫磁珠，并檢測活化磁珠富集病毒的效率。結(jié)果表明1 mg免疫磁珠與75 μg丙型肝炎病毒單克隆抗體偶聯(lián)時(shí)，具有最高抗體偶聯(lián)量，該偶聯(lián)后的磁珠富集丙型肝炎病毒的效率是94.50%；同時(shí)檢測出丙型肝炎病毒高拷貝和低拷貝樣品的重復(fù)性良好。本研究探索的免疫磁珠與熒光定量PCR技術(shù)的結(jié)合具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、簡便快捷以及可信度高的優(yōu)點(diǎn)，為丙型肝炎病毒檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)提供了有利的技術(shù)支持。

丙型肝炎病毒；免疫磁珠；熒光定量

1　前言

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染而引起的嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病[1]。HCV能在肝細(xì)胞中寄生并進(jìn)行無限制復(fù)制，這將引起人體肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，而慢性感染會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為慢性進(jìn)行性肝病，包括肝硬化、肝細(xì)胞癌等[2]，因此盡早檢測出病毒顯得非常重要。HCV感染者血清中丙肝抗原（HCAg）是病毒復(fù)制的一個(gè)標(biāo)志物，感染一周后出現(xiàn)并可被檢測出來。但由于抗原在血清中含量較低，目前的免疫檢測技術(shù)（如熒光定量、膠體金、酶和化學(xué)發(fā)光等）[3]靈敏度不高，因此限制了臨床上HCV抗原的檢出率。

免疫磁珠技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種新的免疫學(xué)技術(shù)，其將免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性和磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、分離速度快和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[4]，應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測中有著突出的優(yōu)勢。通過表面修飾等方法可以賦予磁珠表面存在特殊功能基團(tuán)，這些基團(tuán)可以與特異性免疫配基相結(jié)合，如抗原、抗體、受體等[5]。目前在食品檢驗(yàn)系統(tǒng)中利用磁珠檢測食品金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌，其檢測效果快速、靈敏[6，7]。本研究將帶有羧基基團(tuán)的磁珠進(jìn)行活化后偶聯(lián)HCV單克隆抗體，通過對磁珠偶聯(lián)抗體量的優(yōu)化，探索最佳富集病毒方案，同時(shí)對臨床血清樣本進(jìn)行特異性檢測。

2　材料與方法

2.1材料

2.1.1試劑

羧基修飾磁珠：購于無錫百運(yùn)納米科技有限公司；HCV及單克隆抗體：北京出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心提供；BCA蛋白濃度測定試劑盒：Sigma公司；碳二亞胺（EDC）：上海共價(jià)化學(xué)科技有限公司，純度大于98%；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）：成都貝斯特試劑有限公司，純度大于99%；2-（4-嗎啉）乙磺酸（MES）：東陽市百航化工有限公司，純度99%-99.8%；PBS緩沖液和BSA封閉液：北京索萊寶生物有限公司；Trizol：Invitrogen；氯仿、乙醇和異丙醇：成都化夏化學(xué)試劑有限公司；DNA提取試劑盒：TAKARA。

2.1.2儀器設(shè)備

多功能磁分離器：Biocanal，BCN2001-2；酶標(biāo)儀：Thermo，Multiskan Spectrum；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：蘇州江東精密儀器有限公司，GHP-9050；靜音混合器：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司，WH-986；冷凍離心機(jī)：Eppendorf，5424R；渦旋混合儀：北京大龍，MX-F；RT-PCR儀：ABI公司，7500 fast。

2.1.3引物

Primer 1：5'-CGlACAAACAAIGAGACACC-3'；Primer 2：5'-AGGCTCTAAGATGTTGTCAGC-3'；由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2.2方法

2.2.1免疫磁珠的制備

2.2.1.1活化

取2 mg（25 mg/mL）充分搖勻的羧基磁珠置于2 mL離心管中，加1 mL濃度為0.01 mol/L的MES（pH 5.0，0.05%Tweeb-20）活化緩沖液洗滌磁珠3遍；用磁分離器分離后，分別加入300 μL濃度為5 mg/mL的活化試劑EDC和NHS（均使用0.01 mol/L pH 5.0的MES緩沖液配制）溶液，經(jīng)渦旋混合儀混勻，固定在靜音混合器上，37℃活化45 min；用磁分離器分離磁珠，棄去上清液，加500 μL pH 7.4的PBS緩沖液洗滌3次，每次洗滌需在混合器上充分混合洗滌，再加入200 μL PBS緩沖液，懸浮磁珠。

2.2.1.2偶聯(lián)

取1 mg（100 μL）活化磁珠至2 mL離心管中，加入適量HCV單克隆抗體，用PBS緩沖液補(bǔ)齊至500 μL，用渦旋混合儀混勻，固定在靜音混合器上，37℃偶聯(lián)2 h；用磁分離器分離磁珠，棄去上清液，加入500 μL PBS緩沖液洗滌3次，每次洗滌需在混合器上充分混合洗滌，去除未結(jié)合的抗體。

2.2.1.3封閉

在上述裝有磁珠的離心管中，加入500 μL 1%的BSA封閉液，經(jīng)渦旋混合儀混勻，固定在靜音混合器上，37℃封閉1 h（或4℃封閉過夜）；用磁分離器分離磁珠，棄去上清液，加入500 μL PBS緩沖液洗滌3次，再加入300 μL PBS緩沖液，懸浮磁珠，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2檢測偶聯(lián)最佳抗體量的活化磁珠富集病毒的效率

取6支2 mL離心管各加入1 mg活化磁珠，再分別加入HCV單克隆抗體（1 mg/mL）10、25、50、75、100、250 μg，用PBS緩沖液補(bǔ)齊至500 μL，用旋渦混合儀混勻，固定在靜音混合器上，37℃偶聯(lián)2 h；用磁分離器分離磁珠，收集各管上清液。用BCA試劑盒檢測上述各管上清液中剩余抗體量，用酶標(biāo)儀測定其A562 nm值，可得1 mg磁珠偶聯(lián)抗體的量，計(jì)算偶聯(lián)效率。

此6份1 mg免疫磁珠封閉后各加300 μL濃度為8×105的HCV（試劑中未曾列出），用渦旋儀混勻，室溫固定在混合器上孵育2 h；用磁分離器分離磁珠，棄上清液后加入PBS緩沖液500 μL洗滌3次（每次洗滌需要在混合器中充分洗滌，以除去吸附病毒）；提取免疫磁珠吸附病毒的核酸，檢測吸附不同抗體量免疫磁珠吸附HCV的效率。

2.2.3檢測免疫磁珠捕獲病毒能力

濃度1.52×106拷貝/μL的HCV，按1∶10、1∶100、1∶1000的比例稀釋，取4份1 mg免疫磁珠（偶聯(lián)75 μg丙肝病毒單克隆抗體）分別與原濃度及3個(gè)稀釋比例的病毒吸附，室溫孵育2 h，檢測并計(jì)算富集效率。

2.2.4免疫磁珠捕獲病毒提取核酸（Trizol提取病毒RNA）

在已吸附病毒的免疫磁珠中加入600 μL Trizol，室溫靜置5 min，使其溶解；加入氯仿200 μL，震蕩混勻10-15 s，室溫放置2-3 min；4℃、12000 rpm離心15 min，小心吸取上清透明液體移入一新離心管；加入等體積的異丙醇（約500 μL），上下顛倒混勻，室溫放置10 min，使RNA析出沉淀；4℃、12000 rpm離心10 min，可見白色塊狀RNA沉于管底；小心棄去上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，溫和震蕩，沉淀懸浮即可；4℃、8000 rpm離心5 min，小心棄去上清；室溫晾干5 min，待乙醇蒸發(fā)即可，RNA不要過于干燥；根據(jù)沉淀量多少，取100 μL DEPC水（用焦碳酸二乙酯處理并經(jīng)高溫、高壓滅菌的MiliQ純水），用槍頭吹打，55℃水浴5 min以溶解沉淀（RNA可放入-80℃長期保存），測量濃度及OD值。按表1的組成配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系及反應(yīng)條件。

表1　反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

2.2.5熒光定量PCR檢測

用含有HCV基因組中編碼VP1-VP3衣殼蛋白區(qū)域片段的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒（試劑中未曾列出）制作熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，取濃度范圍9.27×101-9.27×107拷貝/μL的7個(gè)點(diǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用7500 fast Realtime-PCR儀對上述獲得的cDNA進(jìn)行檢測，反應(yīng)體系見表2；同時(shí)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，在60℃3 s-72℃11 s-80℃3 s進(jìn)行44個(gè)循環(huán)，見表3。

表2　普通RT-PCR反應(yīng)體系

表3　普通RT-PCR反應(yīng)條

2.2.6HCV富集效率的計(jì)算

3　結(jié)果與分析

3.1蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1 mg磁珠分別偶聯(lián)10、25、50、75、100、250 μg HCV單克隆抗體后，用酶標(biāo)儀檢測上清液中剩余抗體的量。處理酶標(biāo)儀所檢測的數(shù)據(jù)，選用五參數(shù)的曲線比單純的直線擬合更加精確。圖1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白量與吸光值點(diǎn)對點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測樣本的加樣量在0-10 μg之間，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的吸光度計(jì)算每個(gè)樣本所加的抗體量。根據(jù)加樣體積和上清液總體積換算出上清液中剩余的抗體量及免疫磁珠與HCV抗體的偶聯(lián)效率。

圖1　蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2活化磁珠偶聯(lián)抗體效率

1 mg磁珠分別與10、25、50、75、100、250 μg HCV單克隆抗體偶聯(lián)的結(jié)果見表4。

表4　活化磁珠偶聯(lián)抗體的效率

表4顯示，抗體量過高或過低，其富集效率均降低。當(dāng)1 mg活化的磁珠與25 μg HCV單克隆抗體偶聯(lián)時(shí)，偶聯(lián)效率最高，為55.2%；但是當(dāng)1 mg活化磁珠與75 μg HCV單克隆抗體偶聯(lián)時(shí)，有最大偶聯(lián)量，為17.6 μg。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)的單位活化磁珠均選擇75 μg HCV單克隆抗體偶聯(lián)。

3.3活化磁珠偶聯(lián)不同量的抗體富集效率

將偶聯(lián)HCV單克隆抗體的免疫磁珠吸附300 μL濃度為8×105拷貝/μL病毒，其富集效率見表5。

表5　不同抗體量偶聯(lián)磁珠對富集效率的影響

表5顯示，抗體量過高或過低，其富集病毒的效率均下降。1 mg的活化磁珠與75 μg HCV抗體偶聯(lián)時(shí)，免疫磁珠對丙肝病毒的富集效率最高，達(dá)到94.50%。

3.4單位質(zhì)量免疫磁珠富集病毒能力

4份1 mg免疫磁珠（偶聯(lián)上述最佳效率抗體量）分別與原濃度（1.48×106拷貝/μL）、1∶10、1∶100、1∶1000稀釋的300 μL病毒吸附，結(jié)果見表6。

表6　免疫磁珠吸附不同HCV的富集效率

表6顯示，隨著稀釋倍數(shù)的增加，富集效率降低。

3.5免疫磁珠與熒光定量檢測HCV的方法重復(fù)性檢測

分別取高拷貝（105拷貝/μL）和低拷貝（103拷貝/μL）的HCV血清樣品1份，平行做8管，用免疫磁珠法提取病毒RNA，取5 μL進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果見表7、表8。

表7　HCV高拷貝樣品重復(fù)性檢測

表8　HCV低拷貝樣品重復(fù)性檢測

表7顯示，高拷貝樣品定量的最大值為7.98× 105，最小值為5.89×105，SD為0.75×105，CV為10.90%；表8顯示，低拷貝樣品定量的最大值為1.67×103，最小值為0.96×103，SD為0.23×103，CV為17.56%，結(jié)果說明無論高拷貝樣品還是低拷貝樣品，其檢測重復(fù)性良好。

3.6樣品之間重復(fù)性檢測

取HCV血清樣品10份，用免疫磁珠法提取病毒RNA，取5 μL進(jìn)行熒光定量PCR，每天各測一次，連續(xù)測定4 d，結(jié)果顯示該檢測方法有較高的重復(fù)性（見表9）。

表9　HCV樣品間重復(fù)性檢測結(jié)果與分析

3.7特異性檢測

為了了解該方法的特異性，取12份健康人血清，用免疫磁珠法提取核酸，取5 μL進(jìn)行熒光定量PCR。另外用全血基因組DNA提取試劑盒提取健康人的基因組DNA，取1 μL作為模板用HCV引物進(jìn)行熒光定量PCR。結(jié)果顯示，除陽性對照管外一律為陰性。

4　討論

免疫磁珠技術(shù)利用抗原-抗體結(jié)合原理和物理磁性吸附，從而高效、特異性地捕獲病毒微生物，有效剔除樣本中的雜質(zhì)和非目標(biāo)微生物[4，8，9]。目前免疫磁珠檢測技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，例如牛乳中沙門菌的檢測[10]，免疫磁珠捕獲甲肝病毒以及輪狀病毒也有所報(bào)道[11，12]，但臨床上對于HCV檢測的靈敏度、特異性以及重復(fù)性等諸方面都有很高的要求。本研究利用基于熒光定量PCR和基于納米磁珠捕獲血清病毒核酸提取方法建立了HCV共同檢測體系，不僅有效去除PCR反應(yīng)的抑制物，而且可以吸附完整抗原性的病毒，這彌補(bǔ)了單獨(dú)使用PCR技術(shù)檢測不能表征病毒感染性的不足。另外，使用此方法既可大大提高檢測效率，也降低了檢測難度，可避免假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

本研究選用羧基磁珠，制備了富集HCV的免疫磁珠材料，建立了基于免疫磁珠富集HCV的方法。用單位質(zhì)量羧基磁珠經(jīng)EDC、NHS活化后，與75 μg HCV單克隆抗體偶聯(lián)時(shí)，具有最大抗體偶聯(lián)量；同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過程中，選用Trizol法提取HCV RNA，雖然與Reynolds等[13]研究中提取甲肝病毒核酸方法不同，但卻得到良好的富集效果，單位質(zhì)量免疫磁珠可使病毒濃度為1.48×106拷貝/μL的300 μL丙肝病毒樣本富集效率達(dá)92.57%，其HCV高拷貝與低拷貝樣品重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，保證了富集結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究利用高效、靈敏的熒光定量PCR檢測免疫磁珠富集丙肝病毒的結(jié)果，相比普通PCR法的檢測，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、簡便快捷的特點(diǎn)，對丙肝病毒檢測與評(píng)價(jià)提供了一種有利的技術(shù)支持。

5　結(jié)論

本研究利用免疫磁珠富集與熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測丙型肝炎病毒，相比普通PCR法的檢測，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、簡便快捷的特點(diǎn)，對HCV檢測與評(píng)價(jià)提供了一種有利的技術(shù)支持。

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Detection of Hepatitis C Virus by Immunomagnetic Beads-based Concentration Combined with RT-PCR

CAO Shanshan1，ZHANG Wenling1，WANG Jin1，ZHOU Lulin1，LIU Liu2，WU Yan2，XIAO Lili1*
（1.Beijing International Travel Healthcare Center，Beijing，100088；2.Chongqing University）

The aim of the experiment to build up a detection method of Hepatitis C Virus（HCV）by immunomagnetic combined with RT-PCR.A HCV antibody was coupled with carboxyl groups conjugated to magnetic beads prepared as specific HCV immunomagnetic beads，and detect the activated magnetic beads virus efficiency.The results showed that 1mg immunomagnetic beads and 75 μg hepatitis C virus monoclonalantibodyconjugate，thehighestantibodycouplingandthecouplingofmagneticbeads enrichment efficiency of hepatitis C virus（HCV）is 94.50%.At the same time，the detection of HCV high copy and low copy sample is good repetitions.The results showed that the combination of immunomagnetic beads and fluorescence quantitative PCR has high sensitivity，strong specificity，simple and fast and high reliability advantages and favorable technical support is provided for the test and evaluation of hepatitis C virus（HCV）.

Hepatitis C Virus；Hepatitis C Virus；Real-Time PCR

Q789

E-mail：caoshsh@bjciq.gov.cn；*通訊作者E-mail：xiaoll@bjciq.gov.cn

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015IK342）

2016-03-01