播散性淺表性光化性汗孔角化癥SLC17A9基因突變分析

夏 楊付希安田洪青劉 紅張福仁

·短篇論著·

播散性淺表性光化性汗孔角化癥SLC17A9基因突變分析

夏 楊1，2付希安2田洪青2劉 紅2張福仁2

目的: 檢測11例山東漢族播散性淺表性光化性汗孔角化癥SLC17A9基因突變位點。方法: 提取患者外周血DNA，采用PCR擴增患者SLC17A9基因的全部外顯子及其側(cè)翼序列，對PCR擴增產(chǎn)物直接測序檢測。結(jié)果: 11例播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)患者的SLC17A9基因編碼區(qū)的所有外顯子均未發(fā)現(xiàn)突變。結(jié)論: 本研究中11例DSAP患者的發(fā)病與SLC17A9基因的編碼區(qū)序列無關。

播散性淺表性光化性汗孔角化癥； SLC17A9基因； 基因突變

汗孔角化癥(porokeratosis，PK)是一種常染色體顯性遺傳的慢性進行性角化性皮膚病，具有遺傳異質(zhì)性[1]。本病的發(fā)病誘因有遺傳、免疫抑制、紫外線、感染及外傷等。該病是由 Mibelli于 1893年首次報道[2]，根據(jù)形態(tài)學、皮損分布、臨床特征的不同，目前公認分為5種臨床類型[3]:Mibelli型汗孔角化癥(PM)，播散性淺表性汗孔角化癥(DSP)，播散性淺表性光化性汗孔角化癥(DSAP)，掌跖合并播散性汗孔角化癥(PPPD)，線狀汗孔角化癥(LP)。其中，播散性淺表性光化性汗孔角化癥(Disseminated superficial actinic porokeratosis，DSAP)是一組以環(huán)狀排列的異常角化性皮損為特征表現(xiàn)，主要發(fā)生在曝光部位的常染色體顯性遺傳性皮膚病，它是汗孔角化癥中最為常見的一種類型，30～40歲多見，由Chenosky等于1969年在德克薩斯人群首先描述[4]，DSAP作為一種遺傳性疾病，其表型改變是以基因的改變?yōu)榛A，因此尋找其致病基因不僅可以對疾病做出明確診斷，而且可以在分子水平更好的認識其發(fā)病機制。通過傳統(tǒng)的以家系為基礎的全基因組連鎖分析研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6個DSAP的致病區(qū)域[5-10]:12q23.2-24.1，12q24.1-q24.2，15q25.1-26.1，Ip31.3-p31.1，16q24.1-24.3和20q13.33。2014年，張學軍團隊通過對1個DSAP家系進行全外顯子測序發(fā)現(xiàn)新的致病基因SLC17A9，并在6家系和19個散發(fā)DSAP患者中進行驗證，其中，在DSAP-2家系中發(fā)現(xiàn)SLC17A9基因突變位點1個[10]。為進一步驗證SLC17A9為 DSAP的致病基因，我們對收集到的4例DSAP家系的先證者及7例散發(fā)共11例患者進行SLC17A9基因突變位點檢測。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本研究選擇的用于驗證的DSAP樣本都是經(jīng)之前MVK基因檢測未發(fā)現(xiàn)變異的樣本，從中選擇4例有家族史的DSAP患者以及7例散發(fā)DSAP病例進行基因檢測(圖1、2)。

1.2 材料 外周血DNA的提取:核對臨床資料、臨床圖片及組織病理檢查結(jié)果，從-80℃冰柜取出冷凍保存的血液，采用AXYGEN試劑盒提取基因組DNA。取適量DNA進行純度檢測并標化。

1.3 方法

1.3.1 PCR擴增 通過美國國家生物信息中心(NCBI)基因庫及UCSC數(shù)據(jù)庫檢索到SLC17A9基因的基因組序列，采用Premier Primer5.0軟件設計合適的引物，由北京華大基因科技有限公司合成(表1)。按照說明書將其稀釋為20μmol/L，并采用溫度梯度法探索每一對引物的最佳退火溫度。PCR反應在9700型PCR擴增儀(美國ABI公司)上完成，反應條件為: 94℃預變性3min，94℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)。最后72℃延伸8 min，4℃保存。

圖1 家系圖(1a:家系1；1b:家系2；1c:家系3；1d:家系4。箭頭示進行基因測序檢測的患者)

圖2 2a:散發(fā)1患者腹部典型的DSAP皮損:曝光部位分布的邊緣堤狀隆起，中央輕度萎縮的褐色皮疹2b:散發(fā)1患者右側(cè)臀部和大腿的典型皮損2c:典型的角化不全柱(HE，×200)

表1 本研究中設計的引物

1.3.2 DNA測序 PCR產(chǎn)物采用ABI3130xl遺傳分析儀(美國ABI公司)直接測序。

2 結(jié)果

直接測序結(jié)果SLC17A9基因整個編碼區(qū)具有編碼功能的13條外顯子及其側(cè)翼序列被擴增，并且個別外顯子采用了雙向測序，以確保測序結(jié)果的準確性。11例患者的DNA測序結(jié)果中均未發(fā)現(xiàn)突變位點。

3 討論

DSAP是汗孔角化癥最常見的一種類型，屬常染色體顯性遺傳。暴露于紫外線和輻射治療為本病的誘發(fā)因素。長時間日曬后皮損可加重，因此皮損主要分布于面、頸、軀干、四肢伸側(cè)等曝光部位，表現(xiàn)為離心性角化性丘疹，界清，中央輕度凹陷萎縮，邊緣有突起的嵴。本病的診斷依靠皮損特點、臨床表現(xiàn)及組織病理學檢查。

到目前為止，通過全基因組掃描技術、單倍型和重組連鎖分析等方法共定位了DSAP的6個致病區(qū)域:12q23.2-24.1，12q24.1-q24.2，15q25.1-26.1，1p31.3-p31.1，16q24.1-24.3和20q13.33[5-10]。并在上述 6個致病區(qū)域中，發(fā)現(xiàn) 4個致病基因 SSH1 (12q24.1-q24.2)[11]，SART3(12q24.1-q24.2)[6]，MVK(12q24)[12]和 SLC17A9(20q13.33)[10]，在其他致病區(qū)域未發(fā)現(xiàn)致病基因。

有證據(jù)表明SLC17A9負責溶酶體ATP積累[13]。據(jù)說ATP可激活蛋白酶如溶酶體中的組織蛋白酶D[14]和增加蛋白質(zhì)水解。組織蛋白酶D缺乏可引起溶酶體脂褐質(zhì)累積[15]表明，SLC17A9調(diào)節(jié)溶酶體蛋白水解作用通過保持ATP水平足以激活蛋白酶，如組織蛋白酶D。因此，沒有功能的SLC17A9可以減弱組織蛋白酶D活動，促進脂褐質(zhì)的積累和細胞死亡[13]。

SLC17A9是一種活化的ATP轉(zhuǎn)運蛋白，它編碼蛋白感受不同的刺激因素啟動ATP的轉(zhuǎn)運，如無機鹽離子，蛋白激酶 C等。其中無機鹽離子中包括Ca2+，K+，Cl-以及 Br-等[16]，負電荷無機鹽離子依賴的SLC17A9在結(jié)構上與Cl-依賴的VGLUT相似。外來因素的刺激可以通過不同的通路來激活離子濃度的改變，從而啟動由SLC17A9介導的ATP的轉(zhuǎn)運，比如在T細胞受體受抗原刺激可以激活蛋白激酶C，導致細胞外Ca2+流入，從而啟動ATP轉(zhuǎn)運。與ATP轉(zhuǎn)運伴隨發(fā)生的細胞內(nèi)Ca2+濃度變化對于維持表皮的分化至關重要，表皮屏障功能缺失內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+的丟失可以導致增高水平的細胞增殖和降低水平的分化標記的表達，同樣Ca2+濃度增加可以增加分化水平，抑制增殖[17]。對于角質(zhì)形成細胞，Ca2+通過質(zhì)膜向細胞內(nèi)的運輸對細胞分化進程有至關重要的作用[18]。Ca2+濃度升高可以增加細胞分化水平，同時抑制其增殖。研究證實遺傳性的Ca2+濃度失衡可以導致以多發(fā)性角質(zhì)性丘疹為主要皮損特征的常染色體顯性遺傳性毛囊角化病(Darier病)[19]。與Darier病類似，DSAP同樣表現(xiàn)角化過度，棘層肥厚以及角化不良的病理學特點，文獻中推斷SLC17A9基因變異導致的VNUT與ATP結(jié)合[13]，轉(zhuǎn)運以及釋放異常，同時依賴ATP轉(zhuǎn)運的Ca2+濃度發(fā)生改變，對角質(zhì)形成細胞的增殖和分化產(chǎn)生影響，繼而導致DSAP發(fā)病。

迄今已發(fā)現(xiàn)2個DSAP相關的SLC17A9基因突變位點(表2)，但本研究中11例患者所有SLC17A9基因編碼區(qū)域及側(cè)翼序列均未發(fā)現(xiàn)突變。推測可能的原因:一是突變位點可能位于內(nèi)含子區(qū)域，而我們并沒有檢測所有的內(nèi)含子區(qū)域；二是該病可能存在其他致病基因。下一步我們會對非編碼區(qū)進行測序，檢測內(nèi)含子區(qū)域是否存在突變。

表2 文獻中報道的關于DSAP的致病基因SLC17A9突變位點

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·病例報告·

Analysis of SLC17A9 genemutations in dissem inated superficial actinic porokeratosis

XIA Yang1，2，F(xiàn)U Xi'an2，TIAN Hongqing2，LIU Hong2，ZHANG Furen2.
1.School ofMedicine and Life Sciences，University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China；2.Shandong Provincial Institute ofDermatology and Venereology，Jinan 250022，China

Objective:To identifymutations of SLC17A9 gene in eleven patientswith disseminated superficial actinic porokeratosis.M ethods:After extracting DNA from peripheral blood，all the exons of SLC17A9 gene and their flanking intronic sequences were amplified by PCR，and then direct sequencing was performed to screen themutations in the gene.Results:No mutation was found in any of the exons in SLC17A9 gene from the eleven patients.Conclusion:The pathogenesis of the eleven patients with disseminated superficial actinic porokeratosis is not associated with the sequence of coding region in SLC17A9 gene.

disseminated superficial actinic porokeratosis；SLC17A9 gene；mutation

1濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，濟南，250000 2山東省皮膚病性病防治研究所，濟南，250022

張福仁，E-mail:zhangfuren@hotmail.com