TL1A及其受體DcR3在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)

張麗芳 盛晚香 繆澤群 宋繼權(quán)

TL1A及其受體DcR3在尋常型銀屑病皮損中的表達(dá)

張麗芳 盛晚香 繆澤群 宋繼權(quán)

目的: 檢測TL1A及其受體DcR3在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)。方法: 采用免疫組織化學(xué)法和實時熒光定量RT-PCR法對30例尋常型銀屑病患者皮損中TL1A和DcR3水平進(jìn)行檢測。結(jié)果: 銀屑病組中TL1A和DcR3蛋白陽性表達(dá)率分別為93.3%和90%，正常對照組中TL1A和DcR3蛋白陽性表達(dá)率分別為20%和60%；銀屑病組TL1A mRNA和DcR3mRNA表達(dá)CT值分別為4.909±1.607和3.430±1.449，正常對照組TL1AmRNA和DcR3mRNA表達(dá)CT值分別為1.250±0.650和1.011±0.150，銀屑病組中TL1A和DcR3蛋白及mRNA水平明顯高于正常對照，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。銀屑病皮損中TL1A與DcR3的表達(dá)以及TL1A mRNA與DcR3 mRNA蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān)性(r＝0.735，P＜0.01和r＝0.2436，P＞0.05)。結(jié)論: TL1A和DcR3可能參與銀屑病炎癥的發(fā)生機制。

尋常型銀屑病； 腫瘤壞死因子樣配體1A； 誘騙受體3

目前認(rèn)為銀屑病是一種在多種內(nèi)外環(huán)境因素影響下由多基因遺傳背景控制的T細(xì)胞功能異常的免疫性疾病，涉及到免疫、炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡、微血管異常等多方面原因，其發(fā)病機制尚未完全明了[1]。本文通過檢測銀屑病皮損中TL1A和DcR3的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討銀屑病的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 30例尋常型銀屑病患者，其中男17例，女13例；年齡11～65歲，平均36.5歲；病程3個月～20年，平均5.8年；所有患者近2個月內(nèi)未系統(tǒng)應(yīng)用維A酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物，2周內(nèi)未使用任何外用藥物及接受光療，女性患者排除妊娠哺乳期、月經(jīng)期。15例正常對照來自皮膚科及本院整形外科，其中男7例，女8例，年齡18～60歲，平均28.6歲。銀屑病患者的皮損面積和嚴(yán)重程度按PASI評分為8～24.2，平均17.697±4.547。每一例活檢標(biāo)本均一分為二，一份經(jīng)10%中性福爾馬林液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋用于免疫組化實驗；另一份裝入凍存管中液氮保存，用于RT-PCR實驗。

1.2 試劑 兔抗人TL1A多克隆抗體，兔抗人DcR3多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化SP試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，TL1A抗體工作濃度為1∶50，DcR3抗體工作濃度為1∶50。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化SP法 將組織蠟塊作4μm厚連續(xù)切片，分別做常規(guī)HE染色和免疫組化染色。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。陽性結(jié)果為陽性染色定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞間連接處，并出現(xiàn)黃色或棕褐色的細(xì)小顆粒著色。光鏡下隨機選取高倍視野5處，采用雙評分方法:根據(jù)染色強度評分:無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占的百分率評分:陽性細(xì)胞率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。雙盲法獨立檢測的兩次結(jié)果取平均值，兩種評分的平均值之和為其最終評分。1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～6分判為“+++”。以(+)者為弱陽性、(++)為陽性、≥(+++)為強陽性表達(dá)。

1.3.2 實時熒光定量RT-PCR法 PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。RNA提取按照試劑盒操作步驟采用Trizol法提取RNA，提取后用紫外分光光度計測定OD260/OD280比值，該值在1.8～2.0之間提示純度滿足實驗要求。引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成，使用引物設(shè)計軟件Primer 5.0輔助設(shè)計。引物序列:TL1A:上游引物序列CAAGTCTGTATGCGAAGTAGGT，下游引物序列AAGAAGGCTCCAAAGAAGGT，擴增片段長度為156 bp。DcR3:上游引物序列CTCAATGTGCCAGGCTCTTC，下游引物序列 CCTGGAAAGCCACAAAGTCG，擴增片段長度為 127 bp。β-actin:上游引物序列AGCGAGCATCCCCCAAAGTT，下 游 引 物 序 列GGGCACGAAGGCTCATCATT，擴增片段長度為285 bp。按照說明書操作，反應(yīng)條件:50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃30 s，60℃30 s，40個循環(huán)。行溶解曲線，最終采用2-△△Ct法計算TL1A及DCR3的相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以ˉx±s表示，計量資料均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料比較采用四格表卡方χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TL1A、DcR3與PASI評分的相關(guān)性，TL1A與DcR3間表達(dá)相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TL1A的表達(dá) TL1A在正常皮膚未見明顯表達(dá)，極少可見微弱的免疫反應(yīng)定位于基底角質(zhì)形成細(xì)胞，但在深層真皮或血管周圍是完全缺失的(圖1a)。與之形成鮮明對比，在銀屑病皮損中TL1A表達(dá)于表皮內(nèi)全層細(xì)胞、炎性浸潤細(xì)胞胞漿及真皮小血管周圍，以陽性和強陽性為主(圖1b)。銀屑病患者組TL1A陽性表達(dá)明顯高于正常對照組(χ2＝21.787，P＜0.01)。見表1。

表1 TL1A、DcR3在銀屑病皮損和正常皮膚中的陽性表達(dá)情況 例(%)

2.2 DcR3的表達(dá) 在大多數(shù)正常皮膚中可檢測到DcR3的表達(dá)，主要位于除角質(zhì)層以外的表皮各層角質(zhì)形成細(xì)胞的胞質(zhì)中。另外，在血管周圍區(qū)域，也可見到DcR3的微弱表達(dá)(圖2a)。在銀屑病組中DcR3表達(dá)主要以表皮內(nèi)細(xì)胞胞漿、真皮乳頭層及血管周圍區(qū)域為主(圖2b)。DcR3在銀屑病皮損中的表達(dá)明顯高于正常對照組(χ2＝3.906，P＜0.05)。見表1。

2.3 RT-PCR 見圖3、4。銀屑病組TL1A mRNA與DcR3 mRNA表達(dá)CT值分別為4.909±1.607和3.430 ±1.449，正常對照組TL1A mRNA與DcR3 mRNA表達(dá)CT值分別為1.250±0.650和1.011±0.150，兩組比較銀屑病組TL1A與DcR3的基因表達(dá)水平均明顯高于正常對照組(P＜0.01)(表2、圖5)。

表2 TL1A mRNA與DcR3 mRNA在銀屑病皮損和正常皮膚中的定量表達(dá)(ˉx±s)

圖1 TL1A在正常皮膚(1a)及銀屑病皮損(1b)中的表達(dá)(SP，×100)

圖2 DCR3在正常皮膚(2a)及銀屑病皮損(2b)中的表達(dá)(SP，×100)

圖3 TL1A mRNA在尋常型銀屑病皮損組織和正常皮膚組織中的表達(dá)(1～6為正常人，7～13為尋常型銀屑病患者)

圖5 TL1AmRNA、DcR3mRNA在銀屑病皮損組織及正常組織中的表達(dá)

2.4 相關(guān)性分析 運用Spearman等級相關(guān)性分析顯示:銀屑病皮損中TL1A與DcR3的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(r＝0.735，P＜0.01)，見表3。銀屑病皮損中TL1A mRNA與DcR3 mRNA表達(dá)水平之間及它們分別與PASI之間的相關(guān)性分析，見表4。

表3 銀屑病皮損中TL1A與DcR3的相關(guān)性

表4 銀屑病組皮損TL1AmRNA、DcR3mRNA與PASI及TL1A mRNA與DcR3 mRNA間相關(guān)性分析

3 討論

有大量研究表明，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)作為一種促炎癥性細(xì)胞因子，在銀屑病炎癥反應(yīng)、免疫-信號傳導(dǎo)及新型治療等方面都起到了關(guān)鍵性的作用，這提示家族中的其它成員也可能參與慢性皮膚炎癥反應(yīng)[2，3]。

腫瘤壞死因子樣配體1A(TNF-like ligand 1 aberrance，TL1A)與TNF-α同屬于TNF超家族成員，是一種內(nèi)皮衍生的T細(xì)胞共刺激因子，TL1A不僅能抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還具有獨特的Th1極化特性，通過與其受體DR3或DcR3的結(jié)合，增加輔助性T細(xì)胞因子分泌的生理學(xué)活性，為T細(xì)胞的活化提供第二信號。同時TL1A還能夠增強Th1和Th17細(xì)胞的分化和增殖，Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-23和TNF-α等細(xì)胞因子，其中IL-17具有很強的促炎癥作用，在多種自身免疫性疾病及慢性炎癥反應(yīng)性疾病中都有豐富的表達(dá)[4，5]。目前認(rèn)為細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)及多種免疫活性物質(zhì)的共同參與在銀屑病的發(fā)病和持續(xù)反復(fù)發(fā)作過程中起關(guān)鍵作用，而TL1A與銀屑病的相關(guān)報道很少，Bamias等利用免疫組化和定量RT-PCR技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)并證實銀屑病皮損中TL1A及其受體DR3、DcR3蛋白水平和mRNA表達(dá)水平比正常皮膚增高，提示TL1A參與了銀屑病的病理過程[6]。本實驗通過免疫組化和RT-PCR的方法，對銀屑病皮損進(jìn)行研究，結(jié)果顯示TL1A無論在蛋白還是mRNA水平都有明顯的高表達(dá)，與正常對照組相比較差異有顯著性意義，這與Bamias等的研究結(jié)果相符合。因而它極有可能在銀屑病的免疫反應(yīng)及其慢性炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮作用。

誘騙受體3(decoy receptor3，DcR3)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型免疫分子，是屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員。目前已知DcR3的配體主要有:FasL、LIGHT、TL1A，它與這3種配體的親和力依次為:TL1A＞FasL＞LIGHT[7]。DcR3與DR3競爭結(jié)合TL1A，可以抑制T細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)T細(xì)胞向Th2分化，抑制致炎細(xì)胞因子分泌，降低IL-2的反應(yīng)性活性。另外它與TL1A相互作用能上調(diào)MMP-2mRNA的水平及酶活性，在體內(nèi)促成新生血管的生成[8]。DcR3通過NF-кB依賴途徑上調(diào)ICAM-1、VCAM-1和IL-8的表達(dá)，增加單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性，吸引大量炎癥細(xì)胞在皮膚損害處聚集[8]。目前DcR3在消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌、泌尿系統(tǒng)腫瘤、婦科腫瘤及內(nèi)分泌腫瘤中的研究已有較多報道[9]。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[10]、克羅恩腸病[11]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[12]及急性呼吸窘迫征中[13]，亦發(fā)現(xiàn)DcR3表達(dá)增高現(xiàn)象。DcR3與銀屑病的關(guān)系在國外也有報道，Wu等利用ELISA和免疫組化發(fā)現(xiàn)銀屑病患者血清和皮損中DcR3蛋白水平表達(dá)增高，表明DcR3可能參與了銀屑病慢性炎癥及血管生成的過程[7]。同時也說明DcR3非腫瘤細(xì)胞所特有，在銀屑病這種角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖性疾病中亦存在表達(dá)。本實驗表明，DcR3在正常皮膚與銀屑病皮損中均表達(dá)，二者比較差異有顯著意義。由此推測銀屑病皮損中真皮淺層新生血管的生成及慢性炎癥的過程可能是DcR3陽性表達(dá)增高的結(jié)果。

TL1A與 DcR3在銀屑病皮損組織中共表達(dá)上調(diào)，提示兩者之間可能以協(xié)同或互補的方式共同促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程。銀屑病患者皮損中DcR3 mRNA水平與PASI呈正相關(guān)趨勢(P＜0.05)，提示DcR3與銀屑病的活動性有一定的相關(guān)性。本實驗通過對TL1A、DcR3在銀屑病中的表達(dá)特征及相互關(guān)系的研究證實了兩者在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中都發(fā)揮了重要作用，這也為TL1A、DcR3應(yīng)用于銀屑病的基因治療及生物治療提供了理論依據(jù)。由于條件所限，本研究所涉樣本量小，且尚未對銀屑病發(fā)病過程中的各個時期及非皮損處TL1A及DcR3的表達(dá)進(jìn)行對照研究，在今后的研究中應(yīng)擴大樣本量并充實研究內(nèi)容，并從分子學(xué)水平研究其在銀屑病皮損中的異常表達(dá)。

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Expression of TL1A and its receptor DcR3 in the skin lesions of psoriasis vu lgaris

ZHANG Lifang，SHENGWanxiang，MIAO Zequn，SONG Jiquan.
Department of Dermatology，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan 430071，China Corresponding author:SHENGWanxiang，E-mail:shengwanxiang@126.com

Objective:To investigate the expression of TNF-like ligand 1 aberrance(TL1A)and its receptor decoy receptor3(DcR3)in the skin lesions of the patients with psoriasis vulgaris(PV).M ethods: The expression of TL1A and DcR3 in the skin lesions of 30 patientswith PV was tested with SP immunohistochemical and real-time fluorescence quantitative RT-PCRmethod.Results:The positivity rates of TL1A and DcR3 proteinswere 93.3%and 90%in PV，and were 20%and 60%in the normal samples.The expression levels of TL1A mRNA and DcR3 mRNA were(4.909±1.607)and(3.430±1.449)in PV，and(1.250± 0.650)and(1.011±0.150)in normal skin.The level of TL1A and DcR3 protein and mRNA were significantly higher in PV than that in normal tissue，with a significant difference.There was a positively correlation between the protein level of TL1A and DcR3 in PS(P＜0.01)；TL1A mRNA and DCR3 mRNA expression in psoriatic lesion was a positive correlation(P＜0.05)；TL1A mRNA expression in PSand PASIshows no correlation(P＞0.05)；DcR3 mRNA expression in PS was positively correlation with PASI(P＜0.05). Conclusion:TL1A and DcR3may participate in the pathogenesis of chronic skin inflammation in psoriasis.

psoriasis vulgaris；TNF-like ligand 1 aberrance；decoy receptor3

湖北省自然科學(xué)基金項目(編號:2014CFB360)

武漢大學(xué)中南醫(yī)院皮膚科，湖北武漢，430071

盛晚香，E-mail:shengwanxiang@126.com