響應(yīng)面法對3,5-二硝基水楊酸比色法測定水果中還原糖含量條件的優(yōu)化

李志霞，聶繼云，閆 震，李 靜，匡立學(xué)，沈友明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(興城)，遼寧 興城 125100)

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響應(yīng)面法對3,5-二硝基水楊酸比色法測定水果中還原糖含量條件的優(yōu)化

李志霞，聶繼云*，閆 震，李 靜，匡立學(xué)，沈友明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(興城)，遼寧 興城 125100)

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定水果中還原糖的含量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法(RSM)優(yōu)化DNS法測定蘋果還原糖的最佳條件，同時(shí)建立數(shù)學(xué)模型并驗(yàn)證其可靠性。回歸方程失擬項(xiàng)不顯著(P=0.133 7)，預(yù)測值與實(shí)際值吻合(R2=0.957 4)；影響DNS法測定還原糖含量的因素主次順序?yàn)椋篋NS用量﹥反應(yīng)溫度﹥顯色時(shí)間；DNS法測定還原糖含量的最佳條件為：DNS用量4.0 mL，顯色時(shí)間5.0 min，反應(yīng)溫度87.0 ℃，測得還原糖實(shí)際濃度為94.66 mg/L，與理論預(yù)測值基本相符。按照優(yōu)化的最佳條件，以蘋果、桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿6種代表性水果為對象驗(yàn)證該方法的精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～0.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～4.8%，加標(biāo)回收率為90.6%～104.2%。該方法簡便、快速，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，適合于蘋果及其他水果中還原糖的測定。

還原糖；響應(yīng)面法；3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法；優(yōu)化；水果

隨著人們生活水平的提高，公眾對水果的消費(fèi)需求日益增加。水果可以給人體提供糖類等必需營養(yǎng)物質(zhì)，還可預(yù)防疾病、提高免疫力，有利于健康長壽[1-4]。糖類是水果的重要組成成分，研究表明，還原糖是水果中糖的主要類型，含量最高可占90%以上[5-7]。水果中的還原糖主要為葡萄糖和果糖，其種類及含量在果實(shí)營養(yǎng)價(jià)值和口感風(fēng)味的形成過程中作出了重要貢獻(xiàn)。Crespo等[8]認(rèn)為，果糖比葡萄糖口感更甜，假設(shè)蔗糖的甜度參考值為100%，果糖和葡萄糖的相對甜度值則分別為170.3%和74%。這與許多研究者采用的總甜度指數(shù)=[(1.00×蔗糖) + (0.76×葡萄糖) +(1.50×果糖)] 理論[9]基本一致。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，在2個甜瓜品種成熟過程中，果糖對其甜度形成的貢獻(xiàn)最大。除影響水果品質(zhì)外，還原糖在增強(qiáng)果實(shí)抗逆性、延長貯藏期等方面也發(fā)揮重要作用[11-13]。因此，建立準(zhǔn)確快速測定水果中還原糖的實(shí)驗(yàn)室方法極為重要。

對于還原糖的測定方法，國家標(biāo)準(zhǔn)[14]采用滴定法，但此法操作繁瑣，對滴定終點(diǎn)判斷要求高，不利于實(shí)驗(yàn)室大量樣品的測定。3,5-二硝基水楊酸比色法(DNS法)是半微量定糖法，操作簡便、快捷，雜質(zhì)干擾較少，適合批量測定，是目前實(shí)驗(yàn)室測定還原糖最常用的方法[15]。蘋果、桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿作為仁果類、核果類、漿果類、瓜果類、柑果類、熱帶水果的代表性果品種類，在我國乃至世界的產(chǎn)量均位列前茅[16]，研究并優(yōu)化其還原糖測定方法具有顯著的代表性。本文以還原糖含量為考察指標(biāo)，利用 Design-Expert V8.0.6 軟件中心組合設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)面分析法(Response surface method，RSM)優(yōu)化DNS比色法測定蘋果中還原糖含量的條件，以期獲得最佳測定條件，從而為水果中還原糖的測定提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

U-3900型紫外-可見分光光度計(jì)(日本Hitachi高科公司)；HWS28型電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

葡萄糖(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；3,5-二硝基水楊酸(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；丙三醇、碳酸鈣、亞鐵氰化鉀(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)；乙酸鋅(北京市旭東化工廠)；以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

供試水果樣品蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿均購于本地超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備與樣品還原糖的測定

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與標(biāo)準(zhǔn)溶液單因素試驗(yàn) 精確量取0.0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6 mL濃度為1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于6支10 mL具塞刻度試管中，分別以水調(diào)節(jié)體積至2 mL，各加入3.0 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑并搖勻后，置于沸水中加熱5 min。取出后放入冷水中冷卻至室溫，定容，于540 nm波長處比色。所得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=149.3x+ 0.910 1(式中x表示吸光度，y表示葡萄糖濃度，mg/L)，吸光度與葡萄糖濃度之間呈良好的線性關(guān)系(r2=0.999 5)。

1.2.2 蘋果樣品中還原糖的測定 參照標(biāo)準(zhǔn)[17]方法進(jìn)行。稱取10 g蘋果勻漿于燒杯中，加2 g CaCO3后用水轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，置于80 ℃水浴保溫30 min，取出后加入乙酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液各3.3 mL以沉淀蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，冷卻至室溫后用水定容，過濾。濾液按適當(dāng)比例稀釋并定容后，吸取1 mL樣液進(jìn)行測定。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 單因素試驗(yàn) 以還原糖含量為指標(biāo)，分別考察DNS用量、顯色時(shí)間、反應(yīng)溫度對蘋果樣品中還原糖濃度測定結(jié)果的影響。

1.3.2 RSM優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)(Central composite design)，采用軟件 Design Expert V8.0.6 建立3因素3水平的試驗(yàn)，通過擬合二次多項(xiàng)式方程，確定DNS法測定還原糖的最佳條件。以還原糖濃度(mg/L)為考察指標(biāo)，DNS用量、顯色時(shí)間和反應(yīng)溫度為自變量，因素水平編碼見表1。

表1 試驗(yàn)自變量因素編碼及水平

1.3.3 驗(yàn)證與方法考察 通過軟件分析獲得最佳測定條件后，按照優(yōu)化條件進(jìn)行提取測定，驗(yàn)證預(yù)測值的準(zhǔn)確性。同時(shí)，按照優(yōu)化的最佳測定條件，以不同材料驗(yàn)證該方法的精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度，并考察了該方法與傳統(tǒng)滴定法測定結(jié)果之間的差異顯著性及其時(shí)間穩(wěn)定性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件的Duncan多重比較法(P<0.05)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，EXCEL作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 試劑用量對還原糖含量的影響 吸取2.0 mL提取樣液，分別以水作試劑空白，按照“1.2.1”方法考察了加入 不同DNS試劑用量(0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0 mL)對還原糖含量測定的影響。結(jié)果顯示，隨著DNS用量的增加，測定的蘋果還原糖濃度逐漸升高，當(dāng)用量超過3.0 mL后，還原糖濃度增幅變緩，差異不顯著。為了節(jié)省試劑，實(shí)驗(yàn)選擇3.0 mL DNS為最佳試劑用量。

2.1.2 顯色時(shí)間對還原糖含量的影響 吸取2.0 mL提取樣液，以水做試劑空白，按照“1.2.1”方法分別考察1,3,5,7,10,15,20 min顯色時(shí)間對蘋果還原糖濃度的影響。結(jié)果表明，還原糖濃度隨著顯色時(shí)間的延長而逐漸升高，顯色5 min時(shí)還原糖濃度最大，超過5 min后，還原糖濃度無顯著變化。為保證反應(yīng)穩(wěn)定，選擇5 min為最佳顯色時(shí)間。

2.1.3 反應(yīng)溫度對還原糖含量的影響 吸取2.0 mL提取樣液，以水作試劑空白，按照“1.2.1”方法分別考察了40,50,60,70,80,90,100 ℃反應(yīng)溫度對蘋果還原糖濃度的影響。結(jié)果顯示，在40～100 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，還原糖濃度持續(xù)升高，當(dāng)溫度超過80 ℃后，還原糖濃度趨于穩(wěn)定，差異不顯著。為節(jié)約成本，選擇80 ℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.1.4 顯色溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 將蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿的樣品提取液按照“1.2.1”方法進(jìn)行顯色反應(yīng)后，于540 nm波長下立即比色，掃描0～120 min時(shí)間范圍內(nèi)吸光度值的變化。結(jié)果顯示，6種水果樣液在顯色30 min后，吸光度值下降速率為2.0%～5.2%；顯色60 min后，下降速率為3.0%～9.9%；顯色120 min后，下降速率為5.0%～20.4%。其中以葡萄的穩(wěn)定性最好，油桃的穩(wěn)定性最差。因此，顯色溶液宜在30 min內(nèi)測完，測定油桃樣品時(shí)應(yīng)盡量快速完成。

2.2 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 設(shè)計(jì)方案與結(jié)果 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)“1.3.2”設(shè)計(jì)方案，以RSM中心組合設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。RSM是一種有效的統(tǒng)計(jì)分析方法，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立數(shù)學(xué)模型來實(shí)現(xiàn)受多因素影響的最優(yōu)組合條件的篩選，其中，中心組合設(shè)計(jì)在食品工業(yè)中的應(yīng)用較為廣泛[18-20]。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理對3個主要影響因素進(jìn)行了3因素3水平共20個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)分析試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，試驗(yàn)響應(yīng)值與理論預(yù)測值基本相符。

表2 RSM實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

(續(xù)表2)

NumberIndependentvariablecodevalueIndependentvariablenoncodingvalueResponsevalue(mg/L)X1X2X3DNSamount/mLReactiontime/minReactiontemperature/℃TrialvaluePredictedvalue500-16835631880037908611-14670846686267-1-1-1247077047797800035809287912290168036688089588856101114690951195981100035809003912212000358089439122131-1-144708212829214168004685809406917415-1112690807781771600035809152912217-11-1267078987869181-1144909137934519-168001325807585756320000358091829122

表3 回歸模型的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 各因素對還原糖含量的影響分析 用各因素的F值可評價(jià)該因素對試驗(yàn)指標(biāo)的影響，F(xiàn)值越大，表明該因素的影響越顯著。由表3可知，F(xiàn)(X1)=103.52，F(xiàn)(X2)=2.97，F(xiàn)(X3)=52.18，即用DNS法測定還原糖含量時(shí)，各因素的影響順序?yàn)镈NS用量﹥反應(yīng)溫度﹥顯色時(shí)間。

響應(yīng)曲面的坡度變化及等高線形狀可以反映因素對還原糖含量影響的強(qiáng)弱程度及其交互作用。響應(yīng)曲面坡度陡峭時(shí)，表明響應(yīng)值對處理?xiàng)l件的變化非常敏感；相應(yīng)曲面相對平緩則說明其可容忍處理?xiàng)l件的影響。同時(shí)等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示兩因素交互作用可忽略[22]。考察了DNS用量、反應(yīng)溫度、顯色時(shí)間對測定還原糖含量影響的響應(yīng)曲面和等高線圖。結(jié)果顯示，DNS用量和反應(yīng)溫度之間交互作用顯著，隨著用量增加和溫度升高，還原糖濃度逐漸增大，在用量增至3 mL和溫度升至80 ℃之后逐漸變緩(圖1)。

2.2.4 最佳測定條件及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由Design-Expert V8.0.6軟件分析得出最佳條件：DNS用量為3.94 mL，顯色時(shí)間為5.23 min，反應(yīng)溫度為87.47 ℃，該條件下還原糖含量的理論濃度為96.03 mg/L。為檢驗(yàn)該最佳測定條件的可靠性，進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將測定條件改進(jìn)為：DNS用量4.0 mL，顯色時(shí)間5.0 min，反應(yīng)溫度87.0 ℃。通過3次平行實(shí)驗(yàn)，測得最佳條件下還原糖的濃度為94.66 mg/L，與理論值的相對誤差僅為1.4%。因此，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化DNS比色法測定還原糖的最佳條件是可行的。

2.3 優(yōu)化方法的精密度、重復(fù)性及準(zhǔn)確度

利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化后的條件對蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿中還原糖含量進(jìn)行測定，考察方法的精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度。分別吸取樣液按照優(yōu)化后方法連續(xù)測定9次，根據(jù)測定結(jié)果分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差；測得標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%～0.5%，表明該方法精密度良好；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～4.8%，均低于5.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

按照6種水果的還原糖含量，分別添加約0.5，1.0，2.0倍3個梯度(相當(dāng)于樣品還原糖含量)的葡萄糖后，計(jì)算其回收率，結(jié)果見表4。還原糖的回收率為90.6%～104.2%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 回收率測定結(jié)果

2.4 DNS法與滴定法測定結(jié)果的比較

采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法[14]中的滴定法對蘋果、油桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿中的還原糖含量進(jìn)行測定，重復(fù)測定3次；同時(shí)從“2.3”的9次測定結(jié)果中隨機(jī)選取3次，比較2種方法測定結(jié)果的差異顯著性(表5)。由表5可以看出，除油桃外，采用2種方法測定的還原糖含量均無顯著性差異。分析原因，可能是由于油桃中的還原糖含量偏低，采用滴定法測定時(shí)誤差較大。滴定法測定還原糖時(shí)，對滴定液體積的要求較為嚴(yán)格，需控制在10 mL左右，否則誤差較大[14]。本實(shí)驗(yàn)采用滴定法測定油桃中還原糖含量時(shí)滴定體積超過20 mL，測定結(jié)果應(yīng)以DNS法為準(zhǔn)。

表5 DNS法與滴定法測定6種水果中還原糖含量的比較

3 結(jié) 論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析，建立了DNS試劑用量、顯色時(shí)間以及反應(yīng)溫度對水果中還原糖含量影響的回歸模型，該回歸模型R2=0.957 4，失擬項(xiàng)P=0.133 7﹥0.05，說明該模型與實(shí)際情況擬合良好。在試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，影響DNS法測定還原糖含量的各因素，其影響順序分別為：DNS用量﹥反應(yīng)溫度﹥顯色時(shí)間。最佳條件為：DNS用量4.0 mL、顯色時(shí)間5.0 min、反應(yīng)溫度87.0 ℃，按照優(yōu)化的最佳條件，以蘋果、桃、葡萄、哈密瓜、臍橙、菠蘿6種水果驗(yàn)證該方法的精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.1%～0.5%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.0%～4.8%；回收率為90.6%～104.2%，方法的精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好。除油桃外，其他5種水果的測定結(jié)果與傳統(tǒng)滴定法的測定結(jié)果無顯著差異。該方法為水果中還原糖含量的測定提供了依據(jù)。

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Optimization of 3,5-Dinitrosalicylic Acid Colorimetry Determination Conditions of Reducing Sugar in Fruits by Response Surface Method

LI Zhi-xia，NIE Ji-yun*，YAN Zhen，LI Jing，KUANG Li-xue，SHEN You-ming

(Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Fruit(Xingcheng)，Ministry of Agriculture，Institute of Pomology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xingcheng 125100，China)

The optimum reducing sugar determination conditions of 3,5-dinitrosalicylic acid colorimetry(DNS colorimetry) were investigated using the Response Surface Method(RSM).The reducing sugar content in apple was obtained under the optimum extraction conditions.Based on the results of the single factor experiments，an optimization procedure was carried out in order to investigate the effects of key parameters on reducing sugar determination.Optimization was conducted using a Central Composite Design(CCD) with three key factors of DNS amount，reaction temperature and coloration time.The quadratic term model of the determination conditions was established and the reliability was checked.The results of regression analysis presented a non-significant lack of fit(P=0.133 7) and a high coefficient of determination value(R2) of 0.957 4 for the response surface model,which showed a satisfactory agreement of the polynomial regression equation with experimental data.The influence of three factors followed the sequence as：DNS amount > reaction temperature > coloration time.The optimum determination conditions of reducing sugar using DNS colorimetry were DNS amount：4.0 mL，coloration time：5.0 min，reaction temperature：87.0 ℃.The actual concentration of reducing sugar was obtained to be 94.66 mg/L,which was consistent with the theory predicts under the optimal conditions.According to the optimum determination conditions，the precision，repeatability and accuracy of the method were verified using apple，peach，grape，hami melon，navel orange and pineapple as representative fruits.The standard deviations，relative standard deviations and recoveries of the reducing sugar contents in the 6 fruit species were in the range of 0.1%-0.5%，2.0%-4.8%，90.6%-104.2%，respectively.The study provided a reliable method for accurate，efficient and cost-effective detection of reducing sugar contents in fruits.

reducing sugar;response surface methodology(RSM);3,5-dinitrosalicylic acid(DNS) colorimetry;optimization;fruit

2016-03-28；

2016-04-25

農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂專項(xiàng)(2014301)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(0032014013)；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.011

O657.3;O629.1

A

1004-4957(2016)10-1283-06

*通訊作者：聶繼云，博士，研究員，研究方向：果品質(zhì)量與安全，Tel：0429-3598178，E-mail：niejiyun@caas.cn