番茄抗黃化曲葉病毒病雜交后代比較

張 杰， 王先裕， 荊子桓， 孫嵐明

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530000)

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番茄抗黃化曲葉病毒病雜交后代比較

張 杰， 王先裕*， 荊子桓， 孫嵐明

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧530000)

[目的]篩選黃化曲葉病毒病抗性高的番茄雜交子1代。[方法]通過(guò)番茄雜種子1代的栽培，觀測(cè)各組合的田間生長(zhǎng)情況，對(duì)各組合果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定和分析，采用分子標(biāo)記等方法對(duì)其黃化曲葉病毒病抗性進(jìn)行鑒定。[結(jié)果]雜交子1代TW002和TW008果實(shí)品質(zhì)較優(yōu)，在加工、運(yùn)輸、貯藏方面具有優(yōu)勢(shì)；與TW002相比，TW008的果實(shí)商品率更高、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)更好。黃化曲葉病毒病抗性基因檢測(cè)結(jié)果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010為抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009為雜合材料，TW002、TW007為感病材料；Ty-2中均為感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009為抗病雜合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010為感病純合材料。[結(jié)論]該研究可為抗黃化曲葉病毒病番茄材料的選育提供理論依據(jù)。

番茄黃化曲葉病毒；分子標(biāo)記；雜交子1代；選擇；營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)

番茄(LycopersiconesculentumMiller.)為雙子葉植物綱茄科 (Solanaeeae)番茄屬(Lycopersion)植物。番茄營(yíng)養(yǎng)豐富，富含人們正常生活所需的各種物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素C、胡蘿卜素和番茄紅素等[1]。番茄黃化曲葉病是由番茄黃化曲葉病毒( Tomato yellow leaf curl cirus，TYLCV) 引起的，該病毒主要通過(guò)煙粉虱(Bemisiatobaci)傳染給番茄[2]。該病傳播迅速、范圍廣、危害程度嚴(yán)重、持續(xù)久，嚴(yán)重影響番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量。目前番茄黃化曲葉病毒病的防治措施主要是使用抗性品種和農(nóng)藥。長(zhǎng)期使用農(nóng)藥易出現(xiàn)農(nóng)藥殘留、土壤板結(jié)、環(huán)境污染、毒素積累等問(wèn)題，不利于生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展以及環(huán)境的保護(hù)，因此現(xiàn)在多采用綜合生物防治的方法來(lái)防治番茄黃化曲葉病毒病[3]。1994 年，國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)智利番茄是最好的番茄抗黃化曲葉病毒病資源[4]。Vidavsky等[5]從番茄中發(fā)現(xiàn)抗黃化曲葉病毒基因。Zamir等[6]利用RFLP標(biāo)記，首次將番茄抗黃化曲葉病的基因定位在6號(hào)染色體上(位于著絲粒端)，并將其命名為Ty-1，且RFLP標(biāo)記方法也被應(yīng)用于Ty-1的抗病輔助育種中。Hanson等[7]以野生多毛番茄為材料，利用RFLP標(biāo)記將番茄抗黃化曲葉病的基因定位在了11號(hào)染色體的長(zhǎng)臂終端上，并將其命名為Ty-2，該方法也被應(yīng)用于Ty-2的抗病輔助育種中。Ji等[8]以智利番茄為材料，利用RAPD標(biāo)記確定了抗性位點(diǎn)在第6號(hào)染色體上，并將抗性基因命名為Ty-3和Ty-3a。目前，我國(guó)番茄黃化曲葉病毒病的危害日趨嚴(yán)重，且番茄抗黃化曲葉病毒病的材料品種較少?；诖?，筆者以番茄雜交子1代為研究對(duì)象展開(kāi)試驗(yàn)，觀測(cè)不同組合材料的田間生長(zhǎng)情況、農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，利用分子標(biāo)記等方法對(duì)其黃化曲葉病毒病抗性進(jìn)行鑒定，以期篩選出黃化曲葉病毒病抗性高的番茄雜交子1代，為抗黃化曲葉病毒病番茄材料的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用的雜交子1代按TW001～TW010進(jìn)行編號(hào)。這10份材料均由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系番茄課題組提供；對(duì)照組(CK)為當(dāng)前市場(chǎng)上種植面積較為廣泛的“艾比利”品種。

1.2 果實(shí)營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定項(xiàng)目和方法 每個(gè)小區(qū)隨機(jī)抽取3個(gè)第2穗外觀較好的番茄果實(shí)，重復(fù)3次，取平均值。果實(shí)可溶性固形物含量采用手持折光儀測(cè)定[9]；可滴定酸含量采用酸堿滴定法(GB10474-89)測(cè)定[10]；抗壞血酸含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測(cè)定[11]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[12]；番茄紅素含量采用萃取比色法測(cè)定；計(jì)算糖酸比(可溶性糖與可滴定酸的比值)；利用隸屬函數(shù)[13]判定果實(shí)綜合品質(zhì)，其基本原理是根據(jù)評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)構(gòu)造多個(gè)隸屬函數(shù)，然而每一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)在各個(gè)隸屬函數(shù)的對(duì)應(yīng)程度不同，通過(guò)模糊計(jì)算，可以得到綜合指標(biāo)對(duì)各個(gè)隸屬函數(shù)的數(shù)值得分影響。

1.3 番茄抗性基因的檢測(cè)

1.3.1 試劑和儀器。試劑：2×CTAB(pH 8.0)、NaCl、 EDAB、Tris-d(pH 8.0)、氯仿、異丙醇、醋酸鈉、瓊脂粉、液氮、無(wú)水乙醇、TE緩沖液、dNTP、TEA溶液、TaqDNA聚合酶、MgCl2、BUFFER、6×Loading Buffer、染色堿、2 000 DNA Marker、MIX酶、nuclear free water。儀器：研缽、水浴鍋、振蕩機(jī)、移液槍、點(diǎn)樣板、冰箱、磨樣機(jī)、Sigma1冷凍離心機(jī)、ABI 2720 PCR儀、Q5000型核酸蛋白儀、君意JY600C型電泳儀、微波爐、ChemiDoc MP型凝膠成像系統(tǒng)。

1.3.2 DNA的提取。采用改良的CTAB法對(duì)番茄材料基因組的DNA進(jìn)行提取。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系。①黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1參照華中農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組開(kāi)發(fā)的雙重SNP標(biāo)記[14]；反應(yīng)體系20 μL：2.0 μL的10× Buffer with Mg2+，0.4 μL的dNTPs(2.5 mM)，正向引物和反向引物(100 μmol/L)各0.2 μL，1.0 μL的DNA 模板(200 ng/μL)，0.2 U的TaqDNA聚合酶，ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性，1 min，58 ℃復(fù)性，1 min，72 ℃延伸，1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保持。②黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3參照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供引物程序進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系10 μL： 5 μL的2×GoTaqGreen Master Mix，正向引物和反向引物各0.25 μL，3.50 μL的滅菌ddH2O，1.00 μL的DNA模板(1 000 ng/μL)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性，40 s，55 ℃復(fù)性，40 s，72 ℃延伸，1 min 30 s，32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.3.4 PCR及酶切產(chǎn)物檢測(cè)。PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上 220 V 恒壓電泳15 min，結(jié)果采用2 000 DNA Marker染色，ChemiDoc MP型凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007以及SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄果實(shí)品質(zhì)比較 由表1可知，TW001～TW010番茄果實(shí)中的可溶性固形物含量在6.05%～7.64%，其中TW008果實(shí)中可溶性固形物含量最高，為7.64%，TW003果實(shí)中可溶性固形物含量最低，為6.05%，TW001與TW007之間差異不顯著，其余雜交子1代之間差異顯著；番茄果實(shí)中的可滴定酸含量在327.89～657.55 mg/100 g，其中TW004果實(shí)中可滴定酸含量最高，為657.55 mg/100 g， TW001果實(shí)中可滴定酸含量最低，為327.89 mg/100 g，TW001與TW004、TW007之間均差異顯著，其他材料間均差異不顯著；番茄果實(shí)中番茄紅素含量在24.72～46.79 mg/100 g，其中TW008果實(shí)中番茄紅素含量最高(為46.79 mg/100 g)，TW003果實(shí)中番茄紅素含量最低(為24.72 mg/100 g)，TW001、TW003、TW005、TW007、TW008、TW010、CK之間均差異顯著，TW002與TW006之間差異不顯著；番茄果實(shí)中抗壞血酸含量在13.35～31.72 mg/100 g，其中TW008果實(shí)中抗壞血酸含量最高，TW003果實(shí)中抗壞血酸含量最低，10個(gè)雜交子1代材料中除TW010外，其余材料之間均差異顯著；番茄果實(shí)中可溶性糖含量在297.66～526.80 mg/100 g，其中TW002果實(shí)中可溶性糖含量最高，TW006果實(shí)中可溶性糖含量最低，這10個(gè)雜交子1代材料之間均差異顯著；番茄果實(shí)中糖酸比在0.49～1.22，其中TW001果實(shí)中糖酸比最高， TW007果實(shí)中糖酸比最低，這10個(gè)雜交子1代材料之間均差異顯著。根據(jù)隸屬函數(shù)值可知，TW008得分最高，說(shuō)明其番茄果實(shí)品質(zhì)最好，TW001、TW002、TW004、TW005、TW007、TW008、TW009和TW010的數(shù)值均高于CK，因此，這8個(gè)材料均可在廣西地區(qū)進(jìn)行推廣種植。

表1 大果番茄營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)對(duì)比

注：同列不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。

Note： Different lowercases in the same column indicated significant differences at 0.05 level between treatments.

2.3.2 抗性鑒定分析

2.2.1 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1檢測(cè)結(jié)果。Ty-1基因的雙重SNP標(biāo)記可檢測(cè)出抗病純合、抗病雜合、感病純合材料，當(dāng)純合抗病材料經(jīng)過(guò)PCR電泳過(guò)后，會(huì)出現(xiàn)1條965 bp的條帶，雜合抗性材料會(huì)出現(xiàn)965 bp和1 343 bp 2條DNA帶，而純合感病材料會(huì)出現(xiàn)1條1 434 bp的條帶。由圖1可知，TW001、TW004、TW008和TW010為抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009為雜合材料，TW002、TW007為感病材料。

圖1 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-1檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 Detection results of resistance gene Ty-1 of yellow leaf curl virus

2.2.2 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2檢測(cè)結(jié)果。含有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2的材料可擴(kuò)增出300 bp的條帶，不含黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2的感病材料則擴(kuò)增出600 bp的條帶。由圖2可知，所有的材料均為感病材料。

圖2 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Detection results of resistance gene Ty-2 of yellow leaf curl virus

2.2.3 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3檢測(cè)結(jié)果。含有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的材料可擴(kuò)增出500 bp的條帶，不含黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3的材料可擴(kuò)增出320 bp的條帶。由圖3可知，TW001、TW002、TW004、TW007、TW009為抗病雜合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010為感病純合材料。

圖3 黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3檢測(cè)Fig. 3 Detection results of resistance gene Ty-3 of yellow leaf curl virus

3 結(jié)論與討論

(1)該試驗(yàn)結(jié)果表明，雜交子1代TW002和TW008的可滴定酸、可溶性糖、抗壞血酸含量均較高，其口味、風(fēng)味、甜酸比、酸堿度等較優(yōu)，更有益于貯藏，在加工、運(yùn)輸方面均有優(yōu)勢(shì)，與TW002相比，TW008的果實(shí)商品率更高、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)更好。與對(duì)照品種“艾比利”相比，10個(gè)雜交子1代中有8個(gè)得分高于“艾比利”，尤其是TW008，適合大面積推廣。

(2)黃化曲葉病毒病抗性基因檢測(cè)結(jié)果表明，Ty-1中TW001、TW004、TW008和TW010為抗病材料，而TW003、TW005、TW006、TW009為雜合材料，TW002、TW007為感病材料；Ty-2中均為感病材料；Ty-3中TW001、TW002、TW004、TW007、TW009為抗病雜合材料，TW003、TW005、TW006、TW008和TW010為感病純合材料。TW001、TW004為純合體且抗Ty-1和Ty-3，可作為親本材料；TW003、TW005、TW006、TW009均為雜合材料，需繼續(xù)純化；TW002、TW007材料經(jīng)濟(jì)性狀一般，但感Ty-1、抗Ty-3。TW008感病但經(jīng)濟(jì)性狀好，可作母本，TW010感病又無(wú)性狀，應(yīng)該淘汰。

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科技論文寫作規(guī)范——討論

著重于研究中新的發(fā)現(xiàn)和重要方面，以及從中得出的結(jié)論。不必重復(fù)在結(jié)果中已評(píng)述過(guò)的資料，也不要用模棱兩可的語(yǔ)言，或隨意擴(kuò)大范圍，討論與文中無(wú)多大關(guān)聯(lián)的內(nèi)容。

Comparison on Resistance to Tomato Yellow Leaf Curl Disease of Hybrid Offspring

ZHANG Jie, WANG Xian-yu*, JING Zi-huan et al

(College of Agronomy, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530000)

[Objective] To screen the tomato hybrid F1with high resistance to tomato yellow leaf curl disease. [Method] Through the cultivation of tomato hybrid F1, field growth situation of each combination was observed. The fruit nutritional quality index of each combination was detected and analyzed. Molecular marker and other methods were used to identify the resistance to yellow leaf curl disease. [Result] Fruit qualities of F1TW002 and TW008 were relatively better. Genetic testing results of yellow leaf curl disease showed that TW001, TW004, TW008 and TW010 inTy-1 were all resistant materials; TW001, TW002, TW004, TW007 and TW009 inTy-3 were disease-resistant hybrid materials; TW003, TW005, TW006, TW008 and TW010 were infected homozygous materials. [Conclusion] This research provides theoretical foundation for the resistance breeding of tomato yellow leaf curl disease.

Tomato yellow leaf curl virus; Molecular marker; Hybrid F1; Selection; Nutritional quality

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(桂科攻14121006-5-2，桂科合14123001-3，桂科攻13254002-2)；國(guó)家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系桂林綜合試驗(yàn)站項(xiàng)目(CARS-25-G-37)；百色國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)建設(shè)示范項(xiàng)目(桂科能1598022-1-1)；番茄新品種選育及示范(BB160112)。

張杰(1994-)，男，廣西玉林人，本科生，專業(yè)：園藝。*通訊作者，研究員，從事番茄抗病育種與新品種選育。

2016-08-17

S 641.2

A

0517-6611(2016)29-0014-03