布魯氏菌分離株MLVA分子分型鑒定

馬曉菁，葉 鋒，姚 剛，易新萍，劉 帥，谷文喜，吐爾洪·努爾，馬俊杰，鐘 旗

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布魯氏菌分離株MLVA分子分型鑒定

馬曉菁1，葉 鋒1，姚 剛2，易新萍1，劉 帥2，谷文喜1，吐爾洪·努爾1，馬俊杰1，鐘 旗1

目的 對牛奶、羊奶以及羊流產(chǎn)胎兒中分離布魯氏菌進行分型鑒定。方法 采集新疆4個地區(qū)牛奶20份，羊奶20份，羊流產(chǎn)胎兒10份，分離培養(yǎng)后，運用VirB8-PCR和布魯氏菌分子分型PCR(AMOS-PCR)方法對分離株進行布魯氏菌屬、種的鑒定，同時采用MLVA方法對分離株進一步鑒定，并將測定結(jié)果與http://mlva.u-psud.fr/數(shù)據(jù)庫提供的布魯氏菌數(shù)據(jù)進行比較，結(jié)合軟件BioNumerics 6.6進行聚類分析。結(jié)果 6株分離株均為羊種3型布魯氏菌，與遼寧省分離羊種3型布魯氏菌在聚類分析中關(guān)系較近。結(jié)論 MLVA作為布魯氏菌基因分型鑒定的一種快速、可靠的方法，為今后布魯氏菌傳染源的追溯及防控措施的制定提供依據(jù)。

MLVA; 牛乳; 布魯氏菌; 鑒定

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的世界范圍內(nèi)嚴(yán)重危害畜牧業(yè)和人類健康的人畜共患病。布魯氏菌屬分為9個種[1]，其中牛種和羊種布魯氏菌傳染性較強，也是我國主要流行的布魯氏菌菌種。新疆地區(qū)早在20世紀(jì)50～80年代初就是我國主要的布病疫區(qū)，90年代初新疆布病疫情得到了有效的控制，但此后布病疫情不斷回升[2]。人類可通過直接接觸患病動物感染布魯氏菌病, 患病動物的皮、毛、乳、肉以及內(nèi)臟也是該病重要的傳染源[3-6]。新疆人間布病監(jiān)測結(jié)果顯示2013年乳肉加工人員、畜產(chǎn)品銷售加工人員布病疫情上升較明顯[7]。畜間布病疫情回升不僅嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，同時危害人民健康。

布魯氏菌傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)鑒定方法，雖可以對病畜做出確切的診斷，但鑒定時間長，且對實驗室操作人員具有較高的感染風(fēng)險[8]。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multiplelocus variable-number tandem-repeat analysis,MLVA)是近年發(fā)展起來的以PCR為基礎(chǔ)，根據(jù)被檢菌株散在基因組中不同位點的、變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列(variable number randem repeat，VNTR)的重復(fù)單元拷貝數(shù)的差異來進行分子分型的技術(shù)。該方法具有操作簡單，重復(fù)性好，可比性強等優(yōu)點[9]。本研究利用MLVA方法對牛奶、羊奶以及羊流產(chǎn)胎兒中分離布魯氏菌進行生物型的分析，為追溯傳染源，確定當(dāng)?shù)夭剪斒暇餍汹厔葜贫ㄏ鄳?yīng)的防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對象 分別從新疆不同地區(qū)采集牛奶20份、羊奶20份、羊流產(chǎn)胎兒10份，送實驗室-20 ℃保存。

1.2 主要試劑 布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基(BBLTMBrucella Agar)和布魯氏菌液體培養(yǎng)基均購自Becton and Dickinson company公司，布魯氏菌培養(yǎng)添加劑(OXO ID Ltd)、PCRmix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購自北京莊盟生物有限公司，引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成，PCR產(chǎn)物送北京鼎國生物有限公司測序。牛種布魯氏菌疫苗株A19，羊種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16M均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所布病室保存。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將乳樣混勻取300 μL接種布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基，無菌取流產(chǎn)胎兒脾臟研磨后接種布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃，含5% CO2培養(yǎng)48 h～72 h,觀察細(xì)菌生長情況。

1.3.2 布魯氏菌屬、種PCR鑒定 取布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基生長疑似菌落，接種布魯氏菌肉湯培養(yǎng)基中，增菌培養(yǎng)。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒方法提取DNA作為模板，參照鐘旗[10]等建立的VirB8-PCR方法，擴增布魯氏菌VirB8基因，對分離株進行布魯氏菌屬的鑒定。根據(jù)參考文獻(xiàn)[11-12]采用AMOS-PCR方法對布魯氏菌分離株進行種型的鑒定。反應(yīng)條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 60 s、60 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 MLVA鑒定 合成引物16對Panel 1(Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、Bruce43、Bruce45、Bruce55),Panel 2(Bruce18、Bruce19、Bruce21、Bruce04、Bruce07、Bruce09、Bruce16、Bruce30 )見文獻(xiàn)[13-14]，反應(yīng)體系：PCRmix 12.5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL、分離菌DNA 1 μL雙蒸水補足25 μL，反應(yīng)條件：96 ℃，3 min；96 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。Panel 1引物擴增PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，Panel 2引物擴增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳，并送公司測序。計算獲得各位點的重復(fù)單元數(shù)，整理成Excel表格，將結(jié)果輸入http://mlva.u-psud.fr/，與數(shù)據(jù)庫進行比較，以確定分型，通過軟件BioNumerics 6.6聚類分析，聚類方式采用平均連鎖聚類法(UPGMA)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 40份奶樣、10份羊流產(chǎn)胎兒脾臟接種布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d，觀察菌落生長情況，其中1份牛奶樣，3份羊奶樣，2份流產(chǎn)胎兒脾臟接種的培養(yǎng)基上可見圓形、無色透明、表面凸起的菌落生長。

2.2 布魯氏菌屬VirB8-PCR鑒定 挑取6個培養(yǎng)基上的疑似菌落，增菌，提取基因組DNA作為模板，采用VirB8-PCR方法對疑似布魯氏菌PCR鑒定。分別以牛種布魯氏菌疫苗株A19和大腸桿菌DH5α作為陽性對照和陰性對照。PCR鑒定結(jié)果可見6株分離株均擴增出750 bp左右的條帶，與陽性對照一致，而陰性對照DH5α未擴增出相應(yīng)條帶，見圖1。

M：DNA DL2000 Marker;1:E.coli DH5α；2：牛種布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌A19；3-8：奶樣、流產(chǎn)胎兒中布魯氏菌分離株M：DNA DL2000 Marker;1:E.coli DH5α；2：Standard strain of B.abortus;3-8:Brucella isolated in milk and aborted fetuses圖1 布魯氏菌分離株VirB8-PCR鑒定Fig.1 Identification of Brucella by VirB8-PCR

2.3 布魯氏菌種型AMOS-PCR鑒定 VirB8-PCR鑒定陽性分離株采用AMOS-PCR方法進一步種型的鑒定，牛種A19(1、2、3a、4型)、羊種16M和大腸桿菌DH5α作為陽性對照和陰性對照。鑒定結(jié)果顯示6株布魯氏菌分離株均擴增出731 bp條帶，與羊種布魯氏菌(1、2、3型)擴增結(jié)果一致，見圖2。表明6株分離株為羊種布魯氏菌。

2.4 MLVA分型 分別對6株羊種布魯氏菌分離株16個位點重復(fù)單元PCR擴增,獲得相應(yīng)片段，見圖3。

整理測序結(jié)果計算重復(fù)單元數(shù)，將結(jié)果輸入到http://mlva.u-psud.fr/，與數(shù)據(jù)庫進行比較，結(jié)果見表1。

M：DNA DL2000 Marker;1:E.coli DH5α；2：羊種標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌16M；3：牛種標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌A19；4-9：奶樣及流產(chǎn)胎兒中布魯氏菌分離株M：DNA DL2000 Marker;1:E.coli DH5α；2：Standard strain of B.melitensis;3:Standard strain of B.abortus;4-9:Brucella isolated in milk and aborted fetuses圖2 布魯氏菌分離株AMOS-PCR鑒定Fig.2 Identification of Brucella biotypes by AMOS-PCR

M：DNA DL2000 Marker;1:Bruce 11位點；2：Bruce 06位點；3：Bruce 12位點；4：Bruce 45位點；5：Bruce 08位點；6：Bruce 42位點；7：Bruce 55位點；8：Bruce 43位點M：DNA DL2000 Marker;1：Bruce 11;2:Bruce 06;3:Bruce 12;4:Bruce 45;5:Bruce 08;6:Bruce 42;7:Bruce 55;8:Bruce 43.圖3 布魯氏菌分離株MLVA位點PCR擴增Fig.3 Brucella isolates PCR amplification of MLVA

表1 6株布魯氏菌分離株MLVA分型結(jié)果Tab.1 Result of 6 Brucella strain by MLVA

樣品編號(Straincode)生物型(Biotype)B06B08B11B12B42B43B45B55B18B19B21B04B07B09B16B30NR1羊種3型(B.melitensisbiovar3)153132232420844365NR5羊種3型(B.melitensisbiovar3)1531322324208443610NR8羊種3型(B.melitensisbiovar3)1531322324208543611NR11羊種3型(B.melitensisbiovar3)153132232420844365NR24羊種3型(B.melitensisbiovar3)153132232420844367NR32羊種3型(B.melitensisbiovar3)153132232420844365

VirB8-PCR、AMOS-PCR及MLVA方法對分離株鑒定,結(jié)果表明6株分離株均為羊種3型布魯氏菌,見表2。

2.5 聚類分析 將擴增產(chǎn)物VNTR重復(fù)次數(shù)，經(jīng)BioNumerics 6.6進行聚類分析，結(jié)果可見牛奶、羊奶以及羊流產(chǎn)胎兒中分離6株羊種布魯氏菌與遼寧省分離羊種3型布魯氏菌在聚類分析中關(guān)系較近,見圖4。

表2 6株布魯氏菌分離株鑒定結(jié)果
Tab.2 ientification result of 6 Brucella strain

樣品編號(Straincode)樣品來源(Samplesources)VirB8-PCR方法鑒定結(jié)果(ResultofVirB8-PCR)AMOS-PCR方法鑒定結(jié)果(ResultofAMOS-PCR)MLVA方法鑒定結(jié)果(ResultofMLVA)NR1牛奶(BovineMilk)布魯氏菌(Brucella)羊種布魯氏菌(B.melitensis)羊種3型布魯氏菌(B.melitensisbiovar3)NR5羊奶(SheepMilk)布魯氏菌羊種布魯氏菌羊種3型布魯氏菌NR8羊奶(SheepMilk)布魯氏菌羊種布魯氏菌羊種3型布魯氏菌NR11羊流產(chǎn)胎兒脾臟(sleepnfromabortedfetusesofsheep)布魯氏菌羊種布魯氏菌羊種3型布魯氏菌NR24羊流產(chǎn)胎兒脾臟(sleepnfromabortedfetusesofsheep)布魯氏菌羊種布魯氏菌羊種3型布魯氏菌NR32羊流產(chǎn)胎兒脾臟(sleepnfromabortedfetusesofsheep)布魯氏菌羊種布魯氏菌羊種3型布魯氏菌

圖4 6株布魯氏菌分離株MLVA聚類分析Fig.4 Dendrogram based on the MLVA genotyping assay of the 6 strains of Brucella

3 討 論

布病疫情的回升不僅與疫情程度、流行范圍有關(guān)，更重要的是對布病控制所采取有效的防治策略與措施相關(guān)[14]，針對不同地區(qū)布病流行情況因地制宜采取相應(yīng)的措施能夠有效控制布病疫情。本研究通過分子生物學(xué)方法替代傳統(tǒng)方法完成分離株型的鑒定，與傳統(tǒng)的生物學(xué)鑒定方法相比操作過程簡單、快速，并降低操作人員感染布魯氏菌病的風(fēng)險。多位點數(shù)目可重復(fù)序列分析(MLVA)通過分析VNTR分布進行基因分型研究。Le Flèche P和Al DahouK S[15-16]建立并完善的布魯氏菌MLVA-16位點，將16個位點分為3組，Panel 1包括8個位點，用于布魯氏菌種的比較。Panel 2A包括3個位點，Panel 2B包括5個位點，用于布魯氏菌進一步分型以及菌株間基因型的比較。楊杰[9]等初步建立了我國常見布魯氏菌MLVA分型參考標(biāo)準(zhǔn)操作方法，用于布魯氏菌鑒定、基因分型以及傳染源的追溯、布魯氏菌暴發(fā)和流行的分析。姜海[17]等通過MLVA方法結(jié)合多重PCR對24株犬種布魯氏菌遺傳關(guān)系研究，結(jié)果表明該方法可以用于布魯氏菌種(生物型)的鑒定，成為傳統(tǒng)表型鑒定方法的補充。毛玲玲[18]等采用MLVA方法對遼寧地區(qū)人間分離布魯氏菌33株分型分析，結(jié)果表明遼寧省布魯氏菌存在豐富的多態(tài)性，為布魯氏菌病的防治提供有力的分子生物學(xué)依據(jù)。本研究采用MLVA方法對分離布魯氏菌進行種型的鑒定，結(jié)果可見6株分離株均為羊種布魯氏菌生物3型，與遼寧省分離羊種3型布魯氏菌在聚類分析中關(guān)系較近。

新疆是我國五大牧區(qū)之一，也是布病的老疫區(qū)。我區(qū)布魯氏菌病的防治工作從1954年起開展，上世紀(jì)80～90年代畜間布病疫情大幅度下降，1993年對新疆分離布魯氏菌進行系統(tǒng)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)新疆流行的布魯氏菌有5個種8個生物型，分別為羊種布魯氏菌生物1、2、3型，其中以羊種1型最多，牛種布魯氏菌生物1、3型，其中牛種布魯氏菌生物1型最多，豬種布魯氏菌生物3型，犬種布魯氏菌、綿羊附睪種布魯氏菌[19]。近年來畜間布魯氏菌病疫情持續(xù)上升，2005—2007年家畜總布病陽性率為20世紀(jì)90年代的2倍，2010年家畜布病發(fā)病數(shù)是2006年的4.01倍[20]。本研究從牛奶、羊奶以及羊流產(chǎn)胎兒中分離出羊種布魯氏菌生物3型與近年來新疆地區(qū)及我國其它部分省市布魯氏菌流行菌型一致[21]，表明新疆地區(qū)布病疫情上升可能與家畜引進過程中隔離、復(fù)檢等監(jiān)管措施不力有關(guān)，應(yīng)加強家畜產(chǎn)地檢疫及流通環(huán)節(jié)的監(jiān)督力度。

人間的布病來自畜間，乳和肉等畜產(chǎn)品是人間布魯氏菌病流行的重要傳染因子。因此，在制定合理畜間布病防治措施的同時應(yīng)加強乳和肉等畜產(chǎn)品檢疫、監(jiān)督管理。

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Zhong Qi,Email: yyyzqok@sina.com

Identification and classification ofBrucellastrain with MLVA

MA Xiao-jing1,YE Feng1,YAO Gang2,YI Xin-ping1,LIU Shuai2,GU Wen-xi1,NUER ·Tuerhong1,MA Jun-jie1, ZHONG Qi1

(1.InstituteofVeterinaryMedicine,XinjiangAcademyofAnimalScience,Urumqi830011,China;2.CollegeofAnimalMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi, 830052,China)

We identified the type ofBrucellastrain from milk and abortus.The 20 portions of milk from dairy cows,20 portions of milk and 10 aborted fetuses from sheep were collected from four different area in Xinjiang.The suspected strains were identified by VirB8-PCR and AMOS-PCR.The further comparative analysis was conducted between our results andBrucellafrom database.(http://mlva.u-psud.fr/),and further phylogenetic tree was constructed by BioNumerics 6.6.Results showed that sixBrucellastrain were identified asBrucellamelitensis 3 by MLVA, and were close to theBrucellastrain belonging to Liaoning Province. Multiple Loci VNTR Analysis (MLVA )assays could be applied fast and reliably to detectBrucella.The result of MLVA provide the basis for tracing the source of infection and the scientific basis for the establishment of comprehensive measures for prevention and control of brucellosis.

MLVA;milk;Brucella;identification

鐘 旗，Email：yyyzqok@sina.com

1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830011；

2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院，烏魯木齊 830052

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.008

378

A

1002-2694(2016)08-0722-06

2016-04-20；

2016-05-29

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費項目(No.KY2014008)資助

Supported by the Basic Research Funds in Public Welfare Institution of Xinjiang(No. KY2014008)