中藥提取物抗雞傳染性支氣管炎病毒的體外活性研究

李 麗 谷 穎 王玉堃 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

試驗(yàn)研究

中藥提取物抗雞傳染性支氣管炎病毒的體外活性研究

李 麗 谷 穎 王玉堃 （山東迅達(dá)康獸藥有限公司 山東 濟(jì)南 250300）

將4種中藥提取物稀釋成安全濃度范圍內(nèi)的高、中、低3種濃度，分別與IBV以3種方式加入到培養(yǎng)成單層的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的培養(yǎng)體系中，用MTT法測(cè)定IBV感染細(xì)胞能力的變化。結(jié)果表明，B提取物在先加中藥、后加中藥，與病毒一起加，其A570值均高于病毒組，B具有較好的預(yù)防和治療傳染性支氣管炎病毒的作用。

中藥提取物 雞胚成纖維細(xì)胞 傳染性支氣管炎病毒

傳染性支氣管炎(IB)是由病毒引起的一種僅發(fā)生于雞的急性、高度接觸性的呼吸道疾病[1]。以呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋下降、腎臟病變等為特征。自1988年以來(lái)，IB在我國(guó)大部分地區(qū)相繼流行，其發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率10%～30%。國(guó)內(nèi)每年由此病造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億元[2]。在對(duì)病毒性疾病的治療中，西藥和中藥都各自有其優(yōu)缺點(diǎn)。西藥雖然見(jiàn)效快但毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，許多中草藥及其多種成分都有很好的抗病毒作用，且具有作用獨(dú)特，抗病毒譜廣、毒副作用小、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)正日益成為抗病毒新藥研究的熱點(diǎn)。為研究具有較好抗病毒能力的中藥復(fù)方制劑，前期篩選確定了具有抗病毒活性最強(qiáng)的4味中藥(板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿)，將4味中藥以不同比例配伍提取濃縮得到提取物A、B、C、D。本試驗(yàn)以傳染性支氣管炎病毒

(IBV)為研究對(duì)象，在測(cè)定A、B、C、D 4種提取物對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞(chickembryo fibroblast，CEF)生長(zhǎng)均呈促進(jìn)作用的基礎(chǔ)上選取安全濃度范圍內(nèi)的高中低3種濃度，分別與IBV以3種方式加入到培養(yǎng)24h已長(zhǎng)成單層的CEF中，測(cè)定他們對(duì)IBV病毒感染細(xì)胞能力的影響，選擇藥材的最佳配比，為研制抗IBV病毒的中藥復(fù)方制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品 板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿購(gòu)自濟(jì)南中藥批發(fā)市場(chǎng)，以上4味藥材以(1∶1∶1∶1；1∶2∶1∶1；

1∶2∶2∶1；1∶1∶2∶1)不同比例，加水煎煮2次，2h/次，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.20～1.25(70～80℃測(cè))的清膏，冷至40℃時(shí)緩緩加入乙醇，充分?jǐn)嚢?，使含醇量?0%，靜置12h使沉淀，濾取上清液，遺留沉淀再加60%乙醇適量，充分?jǐn)嚢?，靜置12h，濾取上清液，合并二次上清液，回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮至1ml含1g生藥，收集濃縮液，濾過(guò)，灌裝，滅菌，即得。以上不同比例中藥提取濃縮得樣品為A、B、C、D。根據(jù)對(duì)CEF細(xì)胞安全濃度的測(cè)定結(jié)果[3]，用細(xì)胞維持液分別將A、B、C、D稀釋成高、中、低3種濃度。

1.2 雞胚 9d SPF雞胚，購(gòu)于山東家禽研究所。

1.3 病毒 IBV-M41株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)某教授提供，本實(shí)驗(yàn)室自行傳代保存。將病毒按常規(guī)方法接種9日齡SPF雞胚，37℃恒溫培養(yǎng)72h，收獲尿囊液，連續(xù)雞胚傳代得IBV。按Reed-Muench法[4]測(cè)定IBV對(duì)CEF半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為1×10-6/0.1ml，用細(xì)胞維持液配成100 TCID50濃度備用。

1.4 主要儀器和試劑 MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品，按說(shuō)明書(shū)配制，再加入犢牛血清(Gibco公司產(chǎn)品)，達(dá)5%為細(xì)胞生長(zhǎng)液、2%為細(xì)胞維持液，再按常規(guī)量加入谷胺酞氨和雙抗；胰蛋白酶，進(jìn)口分裝，用PBS(pH值7.4)配制成0.25%溶液，0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后-20℃保存?zhèn)溆茫籑TT(四唑溴鹽)溶液，Sigma公司產(chǎn)品，按說(shuō)明書(shū)配制，使終濃度為5mg/ml，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后4℃冰箱保存，1周內(nèi)用完。MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱，37×B?型生物倒置顯微鏡，DG-5031型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，BT125D型電子分析天平，MH-1型微量振蕩器，24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞培養(yǎng)瓶等。

1.5 試驗(yàn)方法 根據(jù)文獻(xiàn)[4]介紹的方法制備CEF，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整至1×106個(gè)/ml后加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成均勻單層后，翻轉(zhuǎn)細(xì)胞板于滅菌紗布上傾去生長(zhǎng)液，用D-Hank′s液洗兩次，按以下3種方式[5]開(kāi)始分組加藥。（1）先加中藥后接種病毒(藥物預(yù)防試驗(yàn))：相當(dāng)于先加入中藥對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)防，能否提高細(xì)胞抗病毒能力。于各孔中加入高、中、低3種不同濃度的中藥100μl，每種濃度重復(fù)4孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去各孔中藥，再每孔加入100TCID50病毒液100μl；每種濃度分別設(shè)病毒對(duì)照組(細(xì)胞維持液100μl、病毒液100μl)、細(xì)胞對(duì)照組(只加200μl細(xì)胞維持液)和空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞，僅在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)加100μl細(xì)胞生長(zhǎng)液，后分別加細(xì)胞維持液100μl、細(xì)胞維持液100μl)，繼續(xù)培養(yǎng)，以加入病毒液后開(kāi)始計(jì)算時(shí)間，每隔12h觀察1次CPE變化，詳細(xì)記錄結(jié)果，直至病毒對(duì)照組出現(xiàn)典型的CPE病變記錄為終點(diǎn)(一般為72h)，用MTT法[6]測(cè)定570nm處A570值。（2）接種病毒后加中藥(藥物治療試驗(yàn))：每孔加入100TCID50病毒液100μl，先每種稀釋濃度重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，棄去各孔病毒液，再加入高、中、低不同濃度中藥100μl/孔。（3）中藥和病毒同時(shí)加入(直接作用試驗(yàn))：將100TCID50病毒液與各濃度中藥成分4℃條件下感作2h，每孔100μl，做對(duì)照的病毒液以及細(xì)胞維持液4℃相同處理，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、病毒對(duì)照組和細(xì)胞對(duì)照組。此外，設(shè)僅加維持液的無(wú)細(xì)胞孔作為測(cè)定時(shí)調(diào)零孔。（4）當(dāng)藥物的A570值顯著大于病毒對(duì)照組時(shí)，表明有顯著的抵抗傳染性支氣管炎病毒感染細(xì)胞的作用。

1.6 數(shù)據(jù)處理 計(jì)算4孔平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)以Means±SD表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。病毒抑制率通過(guò)方差分析比較不同加藥方式間的差異性，顯著性水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 A組的變化 先加中藥、后加病毒，125μg/ml和250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥，250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)；中藥與病毒同時(shí)加，250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P ＜0.05)(表1)。

表1 A在先加、后加和與病毒同時(shí)加入時(shí)各組細(xì)胞A570值

2.2 B組的變化 先加中藥、后加病毒時(shí)，31.25μg/ml、62.5μg/ml和125μg/ml濃度組的A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥時(shí)，31.25μg/ml和62.5μg/ml濃度組A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)；與病毒同時(shí)加，125、62.5、31.25μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)。31.25μg/ml A570值高于細(xì)胞對(duì)照組(表2)。

表2 B在先加、后加和與病毒同時(shí)加入時(shí)各組細(xì)胞A570值

2.3 C組的變化 先加中藥、后加病毒，16μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥，32μg/ml濃度A570值高于病毒對(duì)照組，但不顯著，中、低濃度的A570值低于病毒對(duì)照組；中藥與病毒同時(shí)加，32μg/ml和8μg/ml濃度組的A570值稍高于病毒對(duì)照組(表3)。

2.4 D組的變化 先加中藥、后加病毒，250μg/ml和 125μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)；先加病毒、后加中藥，125μg/ml濃度A570值高于病毒對(duì)照組，但不顯著；與病毒同時(shí)加，250μg/ml濃度A570值顯著高于病毒對(duì)照組(P＜0.05)(表4)。

表3 C在先加、后加病毒和與病毒同時(shí)加入時(shí)各組細(xì)胞A570值

表4 D在先加、后加和與病毒同時(shí)加入時(shí)各組細(xì)胞A570值

3 討論

3.1 中藥復(fù)方提取物對(duì)IBV感染CEF能力的影響 從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，先加藥物后加病毒時(shí)，A的高、中濃度，B的高、中、低濃度，C的中、低濃度，D的高、中、低濃度，療效都較好；先加病毒后加藥物時(shí)，A的高濃度，B的中、低濃度，C的中、低濃度，效果較好；藥物與病毒同時(shí)加，A的高濃度，B的高、中、低濃度，C的中濃度，D的高、中濃度效果較好。可見(jiàn)，A、B、C、D在先加藥物后加病毒時(shí)療效較好，即對(duì)IBV有較好的抑制作用，B對(duì)IBV還具有較好的治療作用。先加藥后加病毒的方式，和臨床上的預(yù)防非常相似，故該試驗(yàn)的結(jié)果可以作為臨床上預(yù)防用藥的參考。中藥復(fù)方不同提取成分都有不同程度的抗病毒作用，D值不但反應(yīng)活細(xì)胞的多少，也反映細(xì)胞的病變程度，間接地反映病毒增殖的程度，細(xì)胞被病毒感染破壞或干擾了功能后，細(xì)胞受到損壞，線粒體的活性下降，可降低對(duì)四唑鹽在細(xì)胞內(nèi)形成晶體的能力，隨著病毒在細(xì)胞內(nèi)不斷增殖，死亡的細(xì)胞越多，生成的甲簪結(jié)晶就越少，其D值就越低[7]。

3.2 中藥提取物抑制病毒感染細(xì)胞能力與濃度關(guān)系 試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先加藥物后加病毒時(shí)，A的高、中濃度，B的高、中、低濃度，C的中、低濃度，D的高、中、低濃度，療效都較好；先加病毒后加藥物時(shí)，A的高濃度，B的中、低濃度，C的中、低濃度，效果較好；藥物與病毒同時(shí)加，A的高濃度，B的高、中、低濃度，C的中濃度，D的高、中濃度效果較好；說(shuō)明中藥抗病毒需要有合適的濃度，并不是濃度越高療效越好。

3.3 作用機(jī)理 該試驗(yàn)顯示，提取物A、B、C、D對(duì)先加入病毒時(shí)起到顯著的抑制作用，表明中藥成分是通過(guò)改變細(xì)胞膜表面的病毒吸附蛋白受體或作用于細(xì)胞內(nèi)而提高其抵抗能力，阻止病毒侵入細(xì)胞而發(fā)揮預(yù)防作用，或通過(guò)直接滅活病毒來(lái)保護(hù)細(xì)胞[8-9]，B在先接種病毒及與病毒同時(shí)加入時(shí)也起到了抑制作用，說(shuō)明B在細(xì)胞受病毒感染后也能發(fā)揮治療作用。

本研究表明提取物B在預(yù)防和治療方式中，對(duì)IBV感染CEF均有很好的抑制效果，故選板藍(lán)根、大青葉、黃連、淫羊藿最佳比例為1∶2∶1∶1，為研制抗IBV病毒的中藥復(fù)方提供理論依據(jù)。

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S853.73+3

A

1007-1733(2016)11-0001-03

2016-08-10）