HPLC法測(cè)定牛黃解毒片中蒽醌類化合物的含量

刁全平，侯冬巖，郭華，回瑞華

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 鞍山 114007)

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HPLC法測(cè)定牛黃解毒片中蒽醌類化合物的含量

刁全平，侯冬巖，郭華，回瑞華

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 鞍山 114007)

建立同時(shí)測(cè)定牛黃解毒片中大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種蒽醌類化合物含量的方法.用20% H2SO4水解樣品，以丙酮為溶劑，索氏提取樣品中的蒽醌類化合物，流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸水溶液(75∶25，V/V)，色譜柱為 Kromasil C18柱，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，高效液相色譜法測(cè)定4種蒽醌類化合物的含量.樣品中4種蒽醌類化合物分別在1.50～150，0.950～95.0，1.30～130，1.15～115 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線形關(guān)系，測(cè)定的重復(fù)性較好，并在24 h內(nèi)穩(wěn)定，4種化合物加標(biāo)回收率均在98.14%～101.3%之間，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確.該方法操作便捷，準(zhǔn)確，靈敏度高，穩(wěn)定性好，可用于牛黃解毒片的藥物質(zhì)量控制.

牛黃解毒片；蒽醌類化合物；HPLC

牛黃解毒片是由人工牛黃、雄黃、石膏、大黃、黃芩、桔梗、冰片、甘草八味中藥配制而成的一種中成藥，具有清熱解毒的功效[1]，主要用于治療火熱內(nèi)盛、咽喉腫痛、牙齦腫痛、口舌生瘡、目赤腫痛等病癥.蒽醌類化合物具有較強(qiáng)的瀉下、消炎、抗菌作用[2～3]，是牛黃解毒片的主要功效成分，其含量的測(cè)定主要為HPLC法[4～6].牛黃解毒片由八味中藥組成，成份復(fù)雜，在其產(chǎn)品質(zhì)量的控制上有一定的難度.為了更好地控制該制劑質(zhì)量，筆者通過對(duì)樣品中蒽醌類化合物的提取、分離、測(cè)定方法的考查，建立了牛黃解毒片中大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等4種蒽醌類化合物含量的測(cè)定方法，也為牛黃解毒片中藥配伍學(xué)的研究提供一定的支持.

1 儀器與試藥

1525型HPLC儀，配2996型二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，AL-204 電子天平(梅特勒-托利多)，HH-2 型恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司).

大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，均為供含量測(cè)定用.甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)、硫酸、磷酸、丙酮均為分析純，水為二次蒸餾水.

牛黃解毒片(三金集團(tuán)湖南三金制藥有限公司，批號(hào)：140901)購自鞍山某藥房.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Kromasil C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(75∶25，V/V)；柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm;進(jìn)樣量：10 μL.

理論塔板數(shù)按照大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚算分別是9 035,8804,6946,4073，對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖如圖1和圖2所示(注：1.大黃酸；2.大黃素；3.大黃酚；4.大黃素甲醚).

圖1 對(duì)照品色譜圖 圖2 樣品色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精確稱取大黃酸(3.0 mg)、大黃素(1.9 mg)、大黃酚(2.6 mg)、大黃素甲醚(2.3 mg)置于10 mL棕色容量瓶中，乙醇溶解并定容，得大黃酸(300 mg/L)、大黃素(190 mg/L)、大黃酚(260 mg/L)、大黃素甲醚(230 mg/L)對(duì)照品儲(chǔ)備液.

分別移取4種對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶中，乙醇定容，制得大黃酸(3.0 mg/L)、大黃素(1.9 mg/L)、大黃酚(2.6 mg/L)、大黃素甲醚(2.3 mg/L)混合對(duì)照品溶液.

2.2.2 供試品溶液的制備 精確稱取經(jīng)剪刀剪碎的樣品1.0 g左右，置于100 mL圓底燒瓶中，加入20%的H2SO4水溶液20 mL，沸水浴下水解30 min，用布氏漏斗抽濾除去水解液，濾渣用蒸餾水清洗，濾紙和濾渣在80 ℃下烘干后，以丙酮為溶劑進(jìn)行索氏提取，60 ℃水浴提取30 min，回流液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容后為供試品溶液.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將步驟2.2.1制備的對(duì)照品儲(chǔ)備液分別進(jìn)行稀釋，形成系列梯度濃度溶液，HPLC測(cè)定各溶液后，以濃度c(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積A(AU*S)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表1所示.

表1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 精密度試驗(yàn)

取步驟2.2.1制備的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”中色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.17%、0.97%、1.04%和1.08%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好.

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取步驟2.2.2制備的供試品溶液，按“2.1”中色譜條件，分別于0,2,4,8,24 h進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.15%、0.80%、1.04%和0.92%(n=5)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按照步驟2.2.2，制備供試品溶液6份，按“2.1”中色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為0.86%、1.00%、0.45%和1.06%(n=6)，說明本方法重復(fù)性良好.

2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精確稱取樣品約0.5 g3份，分別加入不同質(zhì)量的4種對(duì)照品，按照步驟2.2.2制備供試液，HPLC測(cè)定含量，計(jì)算各對(duì)照品的加標(biāo)回收率，結(jié)果如表2所示.

表2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

2.8 樣品含量測(cè)定

取步驟2.2.2制備的供試品溶液，HPLC進(jìn)行測(cè)定，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其含量，結(jié)果如表3所示.

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本文采用20%硫酸對(duì)樣品進(jìn)行水解，使結(jié)合態(tài)的蒽醌類化合物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，增加樣品測(cè)定的準(zhǔn)確性.比較了二氯甲烷、無水乙醇、甲醇、丙酮、乙醚等不同的索氏提取溶劑，發(fā)現(xiàn)乙醇、甲醇沸點(diǎn)較高，回流需要較高的溫度，二氯甲烷、乙醚提取時(shí)間長(zhǎng)，并且提取不完全，在所考查溶劑中，丙酮的提取效果最為理想，并且在加標(biāo)回收率試驗(yàn)中證明丙酮提取比較完全，因此選用其作為提取溶劑，并對(duì)提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行考查，最后確定60 ℃水浴提取30 min.

HPLC進(jìn)行含量測(cè)定，采用甲醇-0.5%磷酸水溶液體系作為流動(dòng)相，磷酸作為酸劑調(diào)節(jié)色譜峰的峰形，提高分離度，甲醇作為有機(jī)改性劑.甲醇的比例太高，大黃酸峰與雜質(zhì)峰分離效果不好，若甲醇比例太低，延長(zhǎng)分析時(shí)間，當(dāng)甲醇∶0.5%磷酸水溶液=75∶25(V/V)時(shí)，4種蒽醌類化合物都能得到較好的分離，最后選擇其為流動(dòng)相.

[1] 鄭永軍，趙斌，尤進(jìn)茂.微波消解ICP-AES法測(cè)定牛黃解毒片中的微量元素[J].光譜學(xué)與光譜分析，2006，26(6)：1155-1157.

[2] 張丹，蔣心惠.反相高效液相色譜法測(cè)定大黃藥材中游離及結(jié)合型蒽醌類衍生物的含量[J].分析化學(xué)，2003，31(4)：459-462.

[3] 郭華，侯冬巖，回瑞華，等.光譜法測(cè)定蘆薈中蒽醌含量的研究[J].鞍山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，6(4)：43-46.

[4] 許乾麗，茅向軍，宋曉寧，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定六味安消膠囊中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的含量[J].藥物分析雜志，2010，30(10)：1841-1844.

[5] 靳丹虹，梁芳慧，李敬筠，等.微波輔助提取-HPLC測(cè)定決明子中的5種蒽醌類化合物[J].分子科學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(6)：429-433.

[6] 李鑫楠，黃毅嵐，張丹，等.RP-HPLC測(cè)定熊膽降熱丸中的5種大黃蒽醌類化合物[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22(6)：697-698.Determination of anthraquinones in Niuhuang Jiedu Tablets by HPLC

(責(zé)任編輯：陳 欣)

DIAO Quanping,HOU Dongyan,GUO Hua,HUI Ruihua

(School of Chemistry and Life Science，Anshan Normal University,Anshan Liaoning 114007,China)

To establish the method of determination for Rhein,Emodin,Chrysophanol and Physcion in Niuhuang Jiedu Tablets.Sample was hydrolyzed by 20% H2SO4,and anthraquinones were extracted by soxhlet extraction with acetone as solvent,and were determined by HPLC with methanol-0.5% H3PO4(75∶25,V/V)as mobile phase at the flow of 1.0 mL/min,Kromasil C18as Column,292 nm as the detection wavelength.The linear relationship of Rhein,Emodin,Chrysophanol and Physcion were 1.50～150,0.950～95.0,1.30～130,1.15～115 mg/L.The anthraquinones were separated completely and were steady in 24 h,the recovery of 4 anthraquinones were 98.14%～101.3%.This method is rapid,accurate,sensitive and steady,and can be used for the quality control of Niuhuang Jiedu Tablets.

Niuhuang Jiedu Tablets;anthraquinones;HPLC

2016-06-03

刁全平(1980-)，男，山東濰坊人，鞍山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院副教授，碩士.研究方向：天然產(chǎn)物及藥物分析.

R917

A

1008-2441(2016)04-0032-03