牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗的研制及免疫效果觀察

劉來利，李元新，王必成，馮玲霞，張鵬岳

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000）

牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗的研制及免疫效果觀察

劉來利，李元新，王必成，馮玲霞，張鵬岳

（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000）

采用我所分離并保存的對本地區(qū)牛羊肉毒梭菌病具有良好免疫原性的菌株Nb6514研制成功牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗。用免疫牛、羊血清作小白鼠體外中和試驗來測定抗體效價，結(jié)果表明：結(jié)果顯示，免疫10d的牛羊均可抗10個小鼠最小致死量/mL；30d分別可抗30～280和20～240個最小致死量/mL血清；180d達(dá)到高峰，分別可抗300～1600和200～1200個小白鼠最小致死量/mL血清；至550（一年半）仍可抗10個最小致死量/mL血清。結(jié)果表明研制的牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗具有良好的免疫效果，能有效預(yù)防牛羊肉毒梭菌（C型）病。

牛；羊；肉毒梭菌（C型）；滅活苗

肉毒梭菌是一種革蘭陽性厭氧芽孢梭菌，其產(chǎn)生的肉毒毒素能引起人畜嚴(yán)重的中毒癥狀，甚至導(dǎo)致死亡。肉毒梭菌芽孢廣泛分布于自然界，土壤為其自然的存留場所，動物腸道內(nèi)容物、糞便、腐敗尸體、腐爛飼料及其各種植物中都常含有肉毒梭菌芽孢，這種芽孢在適宜的條件下就能生長繁殖產(chǎn)生外毒素。C型肉毒素是迄今為止已知毒力最強的毒素，1mg純毒約含1萬個人的致死量或能使4×1212只小鼠致死。反芻類家畜牛、羊、駱駝及嚙齒類動物鼠、兔、貂等對C型肉毒毒素特別敏感，非常容易引起中毒死亡。這種病常年均有中毒病例發(fā)生，以冬春秋末較為多見，而且發(fā)病可呈幾年連續(xù)性，家畜中青壯年牛羊發(fā)病為多，病死率高達(dá)79.53%。對畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。為此，研制出用于預(yù)防C型肉毒梭菌中毒癥滅活疫苗，并對免疫效果進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報告如下：

1 材料

1.1 種 毒

制造與檢驗用的菌種為C型肉毒梭菌菌株，系1965年從甘肅省安西縣（現(xiàn)為瓜州縣黃牛體內(nèi)），經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定為C型肉毒梭菌菌株?，F(xiàn)由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.2 菌種標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 形態(tài)和生化特性 本菌為革蘭氏陽性粗大桿菌，陳舊培養(yǎng)物往往變成革蘭氏陰性，產(chǎn)生偏端芽孢。生化特征應(yīng)符合細(xì)菌分類學(xué)中本菌的特性。

1.2.2 培養(yǎng)特性 本菌為嚴(yán)格的厭養(yǎng)菌，在肉肝胃酶消化湯半固體培養(yǎng)基中呈中等生長，在厭氣肉肝湯中生長不良或不生長，培養(yǎng)基中加入新鮮生肝塊時，生長良好，產(chǎn)氣，有臭味。在鮮血瓊脂平板上厭氧環(huán)境條件下37℃培養(yǎng)48h，菌落不規(guī)則的圓形，直徑3mm左右，半透明，邊緣不整，有略大于菌落的溶血圈。

1.2.3 血清學(xué)特性 用肉毒梭菌定型血清作中和試驗檢查，應(yīng)為C型。

1.2.4 毒力 各菌株用加入以無菌操作采取的新鮮生肝塊的厭氣肉肝湯或肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)5～7d的菌液上清液0.00005～0.0001mL，腹腔注射體重250～300g豚鼠，應(yīng)在7d內(nèi)死亡。或以0.00001～0.00002mL靜脈注射體重14～16g小白鼠，應(yīng)在3d內(nèi)死亡。

1.2.5 免疫原性 用體重1.5～2kg家兔4只，各皮下注射1mL。21d后連同條件相同的對照兔2只，各靜脈注射10個致死量的毒素，觀察14d對照兔應(yīng)全部死亡，免疫兔應(yīng)至少保護(hù)3只。

1.2.6 純粹 用適宜培養(yǎng)基檢查，應(yīng)純粹。

1.2.7 基礎(chǔ)種子代數(shù)1～10代。

1.3 菌種保存

在2－8℃，保存期為10年。

1.4 試驗動物

試驗動物：豚鼠，體重300～400g；家兔，體重1.5～2.0kg；小白鼠，體重18～22g。

1.5 生產(chǎn)和檢驗用培養(yǎng)基

魚（或）肉胃胃酶消化肉肝湯培養(yǎng)基；硫乙醇酸鹽（TG）培養(yǎng)基，酪胨瓊脂（GA）培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨湯（GP）培養(yǎng)基（中國獸藥監(jiān)督所提供），普通瓊脂斜面、厭氣肉肝湯（甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所提供）。

1.6 佐 劑

氫氧化鋁膠，購自甘肅省某藥廠。

2 方法

2.1 生產(chǎn)用種子制備

2.1.1 一級種子繁殖及鑒定 將菌種接于厭氣肉肝湯或肉肝胃酶消化半固體（含0.05%瓊脂，0.5%明膠）培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3d后，測毒及涂片鏡檢，應(yīng)純粹并用普通瓊脂斜面、厭氣肉肝湯及普通肉湯各 2管，每管接種 0.2mL，培養(yǎng)3～5d，應(yīng)純粹，即作為一級種子管，在2～8℃保存，使用期不超過15d。為便于使用，也可將產(chǎn)芽孢的菌種移植于加新鮮生肝塊厭氣肉肝湯中，在2～8℃保存，每3個月繼代培養(yǎng)1次，在培養(yǎng)基上繼代，不超過4代。

本試驗菌種純粹性檢驗采用上述方法，一級二級種子管培養(yǎng)基均采用保蒲氏胰酶消化半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 二級種子繁殖 將一級種子1～2株，接種于培養(yǎng)中，置37℃培養(yǎng)3～5d，抽樣做純檢，應(yīng)純粹，在2～8℃保存，應(yīng)用期應(yīng)不超過5d。

2.2 制苗用菌液制備

2.2.1 用培養(yǎng)罐或玻璃培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 按容量裝入80%左右的培養(yǎng)基，用玻璃瓶培養(yǎng)時加入1/10肝塊，用反應(yīng)缸時不加肝塊，而按5:1加入氫氧化鋁膠，混合后，118℃滅菌60min，玻璃瓶需或培養(yǎng)罐均需冷至37℃左右，按培養(yǎng)基總量的1% ～2%接入種子，同時加入滅菌的葡萄糖溶液，使其最終含量為0.5%，30～35℃靜止培養(yǎng)5～7d，培養(yǎng)基如經(jīng)存放，在接種前應(yīng)煮沸驅(qū)氧，冷至37℃左右立即接種。

2.2.2 純粹檢驗 菌液培養(yǎng)完成后，取樣接種普通瓊脂斜面、厭氣肉肝湯和普通肉湯各一管，每管接種0.2mL，培養(yǎng)7d，應(yīng)純粹。

2.2.3 毒素測定 每批抽樣測定毒素。用體重14～16g的小白鼠靜脈注射，1mL不應(yīng)低于50000MLD。采用小白鼠腹腔注射測毒，劑量為0.5mL/只，毒素稀釋液采用0.2%明膠磷酸鹽緩沖液（pH為6.8）。采用10倍遞度稀釋。

2.2.4 滅活脫毒 培養(yǎng)罐（或玻璃瓶）培養(yǎng)，按菌液量0.8%加入甲苯醛溶液，并按0.01%加入硫柳汞；在37℃脫毒10d，搖瓶2次/d。

2.2.5 滅活檢驗 每瓶取樣接種普通瓊脂斜面、普通肉湯、加新鮮生肝塊的厭氣肉肝湯，或加0.05%瓊脂、0.05%明膠的半固體培養(yǎng)基各1管，每管接種菌液0.2mL，在37℃培養(yǎng)5～10d，應(yīng)無菌生長。

2.2.6 脫毒檢驗 在無菌檢驗同時，每瓶取樣接種豚鼠，每只皮下注射4mL，觀察7～14d不應(yīng)死亡；或離心取上清液，靜脈注射體重16～20g小白鼠2只，0.4mL/只，觀察5d，不應(yīng)死亡。如有豚鼠或小白鼠死亡，應(yīng)繼續(xù)脫毒。

2.3 配 苗 滅活檢驗合格后，玻璃培養(yǎng)的濾出肝塊，按菌液5份加鋁膠1份的比例加入無菌氫氧化鋁膠，用8%氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH7.0±0.2，充分搖勻。用反應(yīng)缸加鋁膠培養(yǎng)的菌液可直接調(diào)pH7.0±0.2，按配制后的總量的0.004%加入硫柳汞。

2.3.1 半成品檢驗 配苗完成后，取樣做無菌檢驗。做厭氧性、需氧性細(xì)菌檢驗及霉菌及腐生菌檢驗（葡萄糖蛋白胨湯培養(yǎng)基G.P），滅菌效果檢驗（保蒲氏胰酶消化液半固體培養(yǎng)基），應(yīng)無菌生長。

2.3.2 分裝 經(jīng)無菌檢驗合格后，進(jìn)行定量分裝，分裝時應(yīng)隨時攪拌，使其混合均勻。2～15℃保冷暗處存。

2.4 成品檢驗

2.4.1 物理性狀 本品靜置后，上層為橙色澄明液體，下層為灰白色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。

2.4.2 無菌檢驗 每批隨機抽取5瓶滅活苗，混合后取1.0mL接種于含硫硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）50mL，置37℃培養(yǎng)，3d后自小瓶中吸出培養(yǎng)物。分別接種T.G小管和酪胨瓊脂培養(yǎng)基（G.A）各2支，0.2mL/支，1支置37℃培養(yǎng)；1支置25℃，另取0.2mL，接種1支葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（G.P）小管置25℃，培養(yǎng)5d，觀察有無細(xì)菌生長。

2.4.3 安全檢驗 每批苗用體重300～350g豚鼠4只，各皮下注射疫苗4mL觀察21d。

2.4.4 效力檢驗 對不同批次的牛羊肉毒梭菌（C型）濕苗和干粉劑苗用體重1.5～2kg家兔4只，各皮下注射1mL。21d后連同條件相同的對照兔2只，各靜脈注射10個致死量的毒素，觀察14d。

2.4.5 免疫測定 用免疫牛羊血清作小白鼠體外中和試驗，分別在10d、30d、180d、360d進(jìn)行抗體效價測定。

3 試驗結(jié)果

3.1 無菌檢驗 觀察發(fā)現(xiàn)，接種濕苗的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（T.G）小管、酪胨瓊脂斜面（G.A）和葡萄糖蛋白胨湯（G.P）及對照管均無細(xì)菌無細(xì)菌生長。

3.2 安全檢驗 3批濕苗接種檢驗用豚鼠后，試驗豚鼠食欲正常，精神狀態(tài)良好，10d后觀察注射部位無壞死，均健活，安全檢驗合格。見表1

表1 滅活苗的的安全檢驗結(jié)果

3.3 效力試驗 分別對三批溫苗作近期效力試驗，保護(hù)率結(jié)果見表2

表2 滅活苗近期效力試驗結(jié)果

三個批次其中二個批次對10個致死量的C型肉毒梭菌毒素的保護(hù)率為100%，一個批次對10個致死量的C型肉毒梭菌毒素保護(hù)率為75%，對照組的死亡率為100%。

3.4 免疫測定 用免疫牛羊血清作小白鼠體外中和試驗，分別在10d、30d、180d、360d進(jìn)行抗體效價測定。

結(jié)果顯示，免疫10d的牛羊均可抗10個小鼠最小致死量/mL；30d分別可抗30～280和20～240個最小致死量/mL血清；180d達(dá)到高峰，分別可抗300～1600和200～1200個小白鼠最小致死量/mL血清；至550（一年半）仍可抗10個最小致死量/mL血清。

4 小結(jié)與討論

4.1 通過對我所所分離并保存的C型肉毒棱菌Nb6514菌株的抗原結(jié)構(gòu)分析，畢獲恩等研究表明，該菌株與其他5株（Nb6507、Nb6516、Nb65試、Nb6521、Nb6574）的毒素與抗毒素之間的交叉中和力基本一致，并與蘭州生物制品所實驗室保存的91號C型菌均有交叉保護(hù)作用。本項目雖用一株菌體制苗，但對其他菌株有較好地預(yù)防作用。

4.2 對研制的牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗進(jìn)行了無菌檢驗和安全檢驗，試驗結(jié)果表明安全可靠。

4.3 本試驗免疫后10d的牛羊均可抗10個小鼠最小致死量/mL；180d達(dá)到高峰，分別可抗300～1600和200～1200個小白鼠最小致死量/mL血清；至550（一年半）仍具有較高的抗體水平，可抗10個最小致死量/mL血清。這對今后制定牛羊肉毒梭菌（C型）滅活苗的免疫程序和注射后抗體的跟蹤監(jiān)測提供了依據(jù)。

[1]張振興，姜平平主編.實用獸醫(yī)生物制品技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996.5.

[2]朱力，等.肉毒毒素研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2005（2）：186-190.

[3]包玉花，等.引進(jìn)“血清中和試驗法效檢肉毒棱菌（C型）滅活疫苗”的試驗總結(jié)[J].西藏科技，2003（5）：55-56.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.015

甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開發(fā)項目，項目編號：GNSW-2012-15

劉來利（1963～），甘肅省靜寧縣人，本科，副研究員，主要從事動物疫病防治與疫苗開發(fā)研究工作