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    豬口蹄疫O型滅活疫苗制苗毒株的篩選

    2016-11-30 07:38:28李煥斌熊愛輝湖南省邵陽市新寧縣一渡水鎮(zhèn)動物防疫站422714
    中國畜禽種業(yè) 2016年8期
    關(guān)鍵詞:乳鼠O型毒力

    李煥斌 熊愛輝 (湖南省邵陽市新寧縣一渡水鎮(zhèn)動物防疫站 422714)

    豬口蹄疫O型滅活疫苗制苗毒株的篩選

    李煥斌 熊愛輝 (湖南省邵陽市新寧縣一渡水鎮(zhèn)動物防疫站 422714)

    目前我國豬群中主要流行O型口蹄疫病毒,分屬于古典中國 (Cathay)拓?fù)湫?、中東-南亞 (ME-SA)拓?fù)湫汀|南亞 (SEA)拓?fù)湫?。長期以來,豬群中一直以Cathay拓?fù)湫驼純?yōu)勢,經(jīng)過多年的遺傳演化,進(jìn)一步可以分為老毒株和新型毒株。在豬群中不時有中東南亞拓?fù)湫偷姆簛喍局炅餍小?010年前后由于新毒株侵入,又有東南亞拓?fù)湫偷木挼?98型毒株流行。選擇從臨床發(fā)病豬最新分離鑒定的病毒材料12株,經(jīng)綜合分析后篩選發(fā)現(xiàn)O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3個毒株對豬毒力強,對BHK-21細(xì)胞具有良好的適應(yīng)性,免疫原性好,生物學(xué)特性符合疫苗毒株的要求,但其單苗免疫覆蓋面有限,需要進(jìn)一步進(jìn)行組合制備免疫覆蓋面廣的新型疫苗。

    豬口蹄疫;滅活疫苗;疫苗毒株;免疫

    我國豬口蹄疫主要是O型口蹄疫,偶爾也感染亞洲I型和A型口蹄疫。從20世紀(jì)60年代中期開始,O型豬口蹄疫發(fā)病逐漸上升,主要流行毒株為古典中國 (Cathay)拓?fù)湫筒《?,?jīng)過50年的流行,該譜系病毒的感染發(fā)病率發(fā)生明顯變化,出現(xiàn)了所謂老毒株、變異毒株和新變異毒株,病毒的變異使得其致病力越來越強,防控難度越來越大[1]。使口蹄疫疫情更加復(fù)雜和嚴(yán)重的是1999年泛亞毒株侵入我國,該毒株初期主要感染牛群,經(jīng)過10多年在豬群中的變異,出現(xiàn)了泛亞豬體適應(yīng)毒株,該毒株致病力強,曾造成南方數(shù)省豬只死亡。近年來,特別是2010年,由于新型的緬甸-98毒株侵入我國,該毒株對豬群、牛群感染力均很強,造成了重大損失。目前我國豬群中,流行的O型口蹄疫有3個拓?fù)湫?,多個譜系病毒共存的復(fù)雜局面[2]。

    我國采取以免疫為主的綜合防控措施,20世紀(jì)60年代,曾使用弱毒疫苗防疫,80年代研制出了第1代滅活疫苗。雖然推出不少種類的疫苗,但面臨豬口蹄疫病毒流行復(fù)雜的局面,須對豬群中未來可能流行的口蹄疫病毒進(jìn)行1次綜合評價,篩選出免疫普廣的疫苗毒株。

    本研究將通過綜合分析我國豬群中流行的主要病毒株,研究高效、廣譜的新型疫苗以覆蓋目前國內(nèi)豬群中主要流行毒株為目標(biāo)。選擇免疫原性好、抗原普廣、對試驗動物及本動物致病力強、毒力穩(wěn)定,以及對研制疫苗材料具有良好適應(yīng)性的制苗種毒,是疫苗研制和免疫成敗的關(guān)鍵。本試驗將從臨床發(fā)病豬分離鑒定的12株病毒材料分別進(jìn)行VP1核苷酸序列測定、乳鼠適應(yīng)性及毒力測定、細(xì)胞適應(yīng)性及毒力比較、試驗室細(xì)胞傳代和生產(chǎn)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)特性比較和毒力測定,部分毒株對豬感染性測定、抗原關(guān)系分析、免疫普及免疫原性測定,篩選符合制苗毒株要求的候選制苗毒株。

    1 材料與方法

    1.1 試驗動物

    乳鼠:為疾病預(yù)防控制中心引進(jìn)的SPF3日齡乳鼠。

    豬:仔豬和健康長白豬均為購自非口蹄疫疫區(qū),未曾免疫過口蹄疫O型滅活疫苗,經(jīng)檢驗口蹄疫O型血清抗體為陰性 (乳鼠中和抗體效價<1∶4, 或者細(xì)胞中和抗體效價<1∶8,或者ELISA抗體效價<1∶8和3ABC抗體檢測D值小于0.2)。交叉攻毒試驗用豬體重40kg左右,安全性檢驗用豬為30~40日齡。

    1.2 細(xì)胞

    為疾病預(yù)防控制中心引進(jìn)的BHK-21細(xì)胞,傳代后凍存于液氮中;PK15細(xì)胞由疾病預(yù)防控制中心引進(jìn)。

    1.3 毒株的遺傳關(guān)系分析

    將原始病毒材料和本研究傳代3代的病毒材料,按照常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行擴增毒株的VP1基因,PCR產(chǎn)物直接測序,確認(rèn)序列并確定基因型。同時與國內(nèi)外口蹄疫參考毒株進(jìn)行比較,繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。根據(jù)VP1基因核苷酸序列的同源性,分析毒株之間的遺傳學(xué)關(guān)系。

    1.4 毒株主要生物學(xué)特性分析

    1.4.1 病毒的乳鼠適應(yīng)性研究

    將國家口蹄疫參考試驗室提供的12株病毒乳鼠組織毒,分別按照1∶10比例加入MEM培養(yǎng)基研磨制成懸液,4℃浸潤過夜,2~3日齡昆明系小白鼠每只背部皮下注射0.2 mL,逐日觀察記錄乳鼠的發(fā)病死亡情況,棄掉10h內(nèi)死亡的乳鼠,收獲10h后瀕死或者死亡的乳鼠,去掉頭部、皮毛、爪子后,剪成小塊后加入磷酸甘油,于-70℃保存,同時如前步驟處理連續(xù)傳代使乳鼠發(fā)病死亡時間縮短穩(wěn)定在16~30h。記錄各毒株不同代次乳鼠發(fā)病、死亡時間。當(dāng)傳代毒株穩(wěn)定后制備種子批,并測定其對乳鼠的半數(shù)死亡量,以此來評價對乳鼠的毒力[3]。

    1.4.2 病毒的細(xì)胞適應(yīng)性研究

    對12株病毒的傳代乳鼠病毒進(jìn)行BHK-21細(xì)胞適應(yīng)試驗,病毒接種量為10%,培養(yǎng)時間為細(xì)胞出現(xiàn)病變?yōu)橹梗涗浘唧w時間,連續(xù)傳代使收毒時間穩(wěn)定在24h以內(nèi)。連續(xù)盲傳4代不能產(chǎn)生細(xì)胞病變的病毒,通過傳代PK15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞交叉?zhèn)鞔姆椒ㄟM(jìn)行,接毒量為10%,細(xì)胞病變達(dá)到90%以上時收獲病毒。

    1.5 對豬致病性的研究和康復(fù)血清的制備

    將對乳鼠致病力強、細(xì)胞適應(yīng)性好的候選毒株——O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒作1∶10研磨浸潤過夜處理后,肌肉注射2頭易感豬,觀察記錄發(fā)病情況和對豬的毒力,并在21d采血、分離血清,56℃滅活30min后過濾無菌處理后分裝保存,并采用O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒和細(xì)胞中和試驗測定血清效價,用于r值的測定。

    1.6 免疫原性的測定

    將備選毒株各試一批疫苗進(jìn)行交叉攻毒試驗,每種疫苗各免疫40kg左右的健康豬40頭,每頭免疫1頭份,分為4組,每組10頭,免疫28d后分別用檢驗用毒進(jìn)行攻毒試驗,設(shè)立對照組,統(tǒng)計結(jié)果并計算保護(hù)率。

    1.7 制苗候選毒株的確定

    綜合分析各毒株的生物學(xué)特性、遺傳關(guān)系、抗原關(guān)系、免疫原性,從不同的譜系中選擇適宜的制苗毒株。

    2 結(jié)果

    2.1 病毒的鑒定

    2.1.1 病毒序列測定及定型

    將12株病毒進(jìn)行VP1核苷酸序列分析,并與國內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比較,結(jié)果表明,12株病毒均為O型口蹄疫病毒,同源性見表1。12株病毒與OZK的VP1序列的同源性為 76~97%。

    2.2 病毒的生物學(xué)特性

    2.2.1 對豬的致病力研究和康復(fù)血清的制備

    O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株乳鼠MF4代病毒接種豬后,分別于24~48h后發(fā)病,表現(xiàn)明顯的口蹄疫臨床癥狀。最早可見蹄部病變,隨后10d后開始康復(fù)。

    2.2.2 抗原關(guān)系分析

    選擇血清抗體效價較高的豬血清用于中和試驗,將O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11細(xì)胞毒分裝,上述3種血清分別與4個病毒株進(jìn)行交叉細(xì)胞中和試驗,試驗重復(fù)3次計算平均值,見表2。

    由表中數(shù)據(jù)可知O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作為疫苗毒株以最大限度覆蓋目前的豬口蹄疫病毒。

    2.2.3 制苗候選毒株的確定

    通過對12株病毒生物學(xué)特性的研究和遺傳學(xué)關(guān)系分析,選擇了分屬于Cathay拓?fù)湫汀⒅袞|-南亞拓?fù)湫秃蜄|南亞拓?fù)湫偷?株病毒O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株,其對乳鼠、細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性和較強的毒力,3株病毒均表現(xiàn)出良好的免疫原性,綜合分析O/GX/09-7和O/XJ/10-11可以作為制苗株的候選毒株。

    3 結(jié)論與討論

    經(jīng)VP1核苷酸序列測定,分析研究12株病毒屬于中國拓?fù)湫汀⒅袞|-南亞拓?fù)湫?、東南亞拓?fù)湫腿齻€拓?fù)湫蚚4],分別經(jīng)過乳鼠適應(yīng)性及毒力測定、細(xì)胞適應(yīng)性及毒力比較、試驗室細(xì)胞傳代和生產(chǎn)用轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)特性比較和毒力測定、對豬感染性測定和康復(fù)學(xué)清制備、細(xì)胞中和試驗r值測定、單價疫苗制備和豬體攻毒交叉保護(hù)試驗、免疫原性測定,綜合分析后篩選發(fā)現(xiàn)O/HB/07/4、O/GX/09/7、O/XJ/10-11 3個毒株對試驗動物和本動物毒力強,對BHK-21細(xì)胞具有良好的適應(yīng)性,免疫原性好,生物學(xué)特性符合疫苗毒株的要求,但其單苗免疫覆蓋面有限,需要進(jìn)一步進(jìn)行組合制備免疫覆蓋面廣德新型疫苗。

    表1 12株病毒VP1核苷酸序列分析結(jié)果

    表2 3種血清抗原關(guān)系

    采用O/HB07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株的遺傳關(guān)系分析、乳鼠及細(xì)胞適應(yīng)性研究、抗原關(guān)系測定、免疫原性等方法綜合研究,全面對豬群中流行的不同拓?fù)湫設(shè)型口蹄疫病毒進(jìn)行分析,初步掌握了豬群中O型病毒的抗原關(guān)系,為研究保護(hù)覆蓋面較為寬的豬O型口蹄疫滅活疫苗提供了支持。

    目前我國豬群中主要流行O型口蹄疫病毒,分屬于Cathay拓?fù)湫汀⒅袞|-南亞拓?fù)湫?、東南亞拓?fù)湫?,長期以來,豬群中一直以Cathay拓?fù)湫驼純?yōu)勢,經(jīng)過多年的遺傳演化,進(jìn)一步可以分為老毒株和新型毒株。在豬群中不時有中東南亞拓?fù)湫偷姆簛喍局炅餍小?010年前后由于新毒株侵入,又有東南亞拓?fù)湫偷木挼?98型毒株流行。

    緬甸-98譜系從2003年就已有該譜系病毒流行,近年來逐漸流行面擴大,從一個側(cè)面反映出現(xiàn)流行疫苗存在一些問題。該譜系病毒不易直接適應(yīng)BHK-21細(xì)胞,但是經(jīng)過傳代3次后收毒,綜合評價其細(xì)胞毒價和乳鼠毒價,有良好的乳鼠適應(yīng)性和細(xì)胞適應(yīng)性。綜合考慮,O/HB/07-4株、O/GX/09-7株和O/XJ/10-11株MF 4代病毒接種豬后,發(fā)現(xiàn)部分豬肌肉注射接種病毒后無任何反應(yīng),觀察10d后再采血檢測血清抗體仍然維持陰性,提醒試驗研究時應(yīng)注意選擇動物和疫苗質(zhì)量評價,選擇動物時不僅要注意有無口蹄疫抗體,還要注意豬的易感性,同時提醒應(yīng)注意研究口蹄疫不同感染途徑與致病性的關(guān)系。

    [1]王繼華,邵明,施程洪,等.抗原濃縮純化工藝降低口蹄疫O型和Asia 1型二價滅活疫苗免疫副反應(yīng)研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2011(1):58-61.

    [2]王繼華,邵明,施程洪,等.抗原濃縮純化工藝對口蹄疫滅活疫苗免疫效果評價[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2011,31(5):684-686.

    [3]庫大亮,李冬.口蹄疫滅活疫苗的生產(chǎn)工藝概述[J],中國獸藥雜志,2011,45(1):41-44.

    [4]周春雷,李冬.口蹄疫及其防制簡介[J].中國動物保健,2011(10):40-44.

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