凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性與顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的關(guān)系

栗超躍 趙黎明△ 史錫文 裴兵兵 常運(yùn)光 甘 強(qiáng) 杜文錦

1)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院 鄭州 450003

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凝血因子Ⅶ基因多態(tài)性與顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的關(guān)系

栗超躍1)趙黎明1)△史錫文1)裴兵兵1)常運(yùn)光1)甘 強(qiáng)1)杜文錦2)

1)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院 鄭州 450003

目的 觀察FⅦ基因多態(tài)性對(duì)FⅦa活性的影響，探討FⅦ基因多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的關(guān)系。方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性或直接PCR方法檢測(cè)FⅦ多態(tài)性基因型。結(jié)果 凝血功能障礙和正常組FⅦ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性基因型和等位基因分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 FⅦ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性有關(guān)，F(xiàn)Ⅶ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷患者凝血功能障礙有關(guān)。

凝血因子Ⅶ；顱腦損傷；多態(tài)性；凝血功能障礙

凝血因子Ⅶ(FⅦ)是肝細(xì)胞分泌的一種自然狀態(tài)下以單肽鏈的酶原形式存在的維生素K依賴性單鏈絲氨酸蛋白酶，水解后可活化為雙肽鏈形式，且自身促凝活性增加。FⅦ是外源性凝血途徑的具有催化活性作用的一種酶，與組織因子結(jié)合啟動(dòng)外源性凝血過程[1]。顱腦創(chuàng)傷引起腦內(nèi)組織因子大量釋放以及血腦屏障的開放啟動(dòng)了以FⅦ為核心的外源性凝血途徑[2]。研究報(bào)道[3]，血漿FⅦa活性下降是單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。另有研究表明[4-6]，F(xiàn)Ⅶ基因-323P0/P10、R353Q、-401G/T、-402G/A、-670A/C和IVS7多態(tài)性與急性冠脈綜合征、心肌梗死以及腦卒中的易感性有關(guān)。有關(guān)FⅦ基因多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷患者血漿FⅦa活性及凝血功能障礙易感性的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外尚無相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討FⅦ基因多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料和方法

1．1 臨床資料 本研究以河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科急救中心2012-03—2015-03住院的急性顱腦創(chuàng)傷患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～<70歲；(2)明確的頭部外傷史，單純中重型顱腦創(chuàng)傷患者(最佳GCS 5～12分，其他部位AIS≤3)，并經(jīng)頭顱CT證實(shí)，發(fā)病24 h內(nèi)入院；(3)受試者或其法定代表人簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)外傷后預(yù)期壽命<24 h；(2)頭顱CT掃描時(shí)創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)間不明或>24 h；(3)開放性顱腦損傷；(4)體質(zhì)量>90 kg；(5)既往有腦部疾病(外傷性或非外傷性)伴永久神經(jīng)缺陷者；(6)自身免疫性疾?。?7)急性或慢性感染性疾病。收集顱腦創(chuàng)傷患者877例，根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)，最終240例納入研究范圍，其中凝血功能障礙108例，凝血功能正常132例。入組患者均在入院后24 h內(nèi)采集空腹外周靜脈血10 mL，枸櫞酸鈉抗凝處理后放置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 主要材料與試劑 血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技有限公司，引物合成由上海生物工程有限公司完成，Vortex Genie 2渦旋振蕩器(上海迭戈生物科技有限公司)，PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometrd公司)，Mini protean Ⅲ電泳儀與Bio-rad垂直電泳槽(北京伯樂生命科學(xué)發(fā)展有限公司)。

1．3 PCR-RFLP方法檢測(cè)入組患者FⅦ基因型 引物合成和PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[1-2，7-9]，本研究選用濃度為2%的瓊脂糖凝膠，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。FⅦ基因多態(tài)性目的片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物需要進(jìn)一步經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定。取經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增良好的PCR產(chǎn)物6 μL，加入對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶配成酶切反應(yīng)體系，在適宜溫度下恒溫孵育。最終將染色后的聚丙烯酰胺凝膠置于紫外檢測(cè)儀下觀察并用凝膠成像分析系統(tǒng)攝影。

2 結(jié)果

2．1 血漿FⅦa活性與FⅦ基因多態(tài)性的關(guān)系 血漿FⅦa高活性組與低活性組患者FⅦ基因多態(tài)性分析結(jié)果見表1。

表1 血漿FⅦa活性與FⅦ基因多態(tài)性的相關(guān)性

血漿FⅦa高活性組與低活性組患者-402G/A多態(tài)性基因型GG402、GA和AA的頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，等位基因G和A的頻率分布也有顯著性差異(P<0.05)，F(xiàn)Ⅶ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性有關(guān)。GG402基因型攜帶者血漿FⅦa活性相對(duì)高于AA基因型攜帶者，等位基因G402可能對(duì)維持血漿FⅦa處于較高水平有促進(jìn)作用；而FⅦ基因-323P0/P10、R353Q、-670A/C和IVS7多態(tài)性基因型和等位基因的頻率分布與血漿FⅦa活性均無相關(guān)性。

2．2 凝血狀態(tài)與FⅦ基因多態(tài)性的關(guān)系 單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正常患者與FⅦ基因多態(tài)性的相關(guān)性分析結(jié)果見表2。

表2 單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙與FⅦ基因多態(tài)性的相關(guān)性

單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正?；颊逨Ⅶ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性對(duì)應(yīng)基因型GG402、GA、AA和H7H7、H7H6、H6H6的頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，等位基因G402、A和H7、H6的頻率分布也有顯著性差異(P均<0.05)。FⅦ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性可能與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率有關(guān)。單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正常患者FⅦ基因-323P0/P10和-670A/C多態(tài)性基因型和等位基因的頻率分布與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率無相關(guān)性。

3 討論

FⅦ基因-402G/A[2]多態(tài)性屬于DNA單核苷酸多態(tài)性，是由于FⅦ基因402處鳥嘌呤核苷酸(G)被胸腺嘧啶核苷酸(T)置換。IVS7多態(tài)性則是指FⅦ基因第7內(nèi)含子區(qū)域第4高變區(qū)(HVR4)中不同拷貝數(shù)的重復(fù)序列，也可稱為HVR4多態(tài)性，是一種DNA重復(fù)序列多態(tài)性，其重復(fù)序列為37 bp(5'-CTGGGTGGGTACCACTCTCCCCTGTCCGACCGCG GTG-3')，該基因多態(tài)性于1991年由Marchetti等首次報(bào)道。目前認(rèn)為，-402G/A多態(tài)性影響血漿FⅦ水平的可能機(jī)制是由于啟動(dòng)子區(qū)域該位點(diǎn)的1個(gè)等位基因的堿基發(fā)生顛換，改變了FⅦ基因正常序列。IVS7多態(tài)性是由于重復(fù)序列而影響FⅦ基因mRNA的剪接，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄活性，從而使血漿FⅦa活性下降[9]。目前大多數(shù)研究認(rèn)為，與H6H6多態(tài)性相比，H7H7多態(tài)性與血漿較低FⅦa活性相關(guān)[4，9]。

本研究結(jié)果顯示，盡管FⅦ基因-402位點(diǎn)G/A多態(tài)性基因型和IVS7位點(diǎn)H6H6基因型攜帶者血漿FⅦa活性最高，但分別與GG402、AA402和H7H7、H7H6基因攜帶者之間血漿FⅦa活性無顯著差異；但血漿FⅦa高活性組與低活性組患者及單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正常患者-402G/A多態(tài)性基因型GG402、GA和AA402的頻率分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示FⅦ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性和單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率有關(guān)，GG402基因型攜帶者血漿FⅦa活性相對(duì)高于AA基因型攜帶者，而且GG402基因型攜帶者顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙的幾率也相對(duì)低于AA402基因型攜帶。因此認(rèn)為，等位基因G402可能對(duì)維持血漿FⅦa處于較高活性有促進(jìn)作用，同時(shí)提示等位基因G402可能對(duì)降低單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙具有積極作用，可能是單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的保護(hù)性基因。

IVS7僅僅在單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙和凝血功能正?；颊呋蛐秃偷任换虻念l率分布存在顯著性差異，其中H6H6基因型攜帶者顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙的幾率相對(duì)低于H7H7基因型攜帶者，同時(shí)提示等位基因H6可能對(duì)降低單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙具有積極作用，可能是單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的保護(hù)性基因。

雖本研究結(jié)果表明FⅦ基因-402G和IVS7與血漿FⅦa水平和單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙有關(guān)，但同時(shí)也與既往研究結(jié)果存在差異，造成這種差異的原因可能是多方面的，但主要原因可能是研究對(duì)象和研究方法的差異。本研究只分析了單一位點(diǎn)多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能狀態(tài)的關(guān)系，而未聯(lián)合分析2個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能狀態(tài)的影響，故需進(jìn)一步研究。

綜上所述，F(xiàn)Ⅶ基因-402G/A多態(tài)性與血漿FⅦa活性有關(guān)，等位基因G402可能對(duì)維持FⅦa處于較高活性有促進(jìn)作用；FⅦ基因-402G/A和IVS7多態(tài)性與單純性顱腦創(chuàng)傷后凝血功能障礙的發(fā)生率有關(guān)，等位基因G402和H6可能對(duì)降低單純性顱腦創(chuàng)傷后發(fā)生凝血功能障礙具有積極作用，可能是單純性顱腦創(chuàng)傷性凝血功能障礙的保護(hù)性基因。

[1] Pike AC，Brzozowski AM，Roberts SM，et al．Structure of human factor Ⅶa and its implications for the triggering of blood coagulation[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(16)：8 925-8 930．

[2] Hoffman M，Monroe DM．Tissue factor in brain is not saturated with factor Ⅶa：implications for factor Ⅶa dosing in intracerebral hemorrhage[J]．Stroke，2009，40(8)：2 882-2 884．

[3] 栗超躍，裴兵兵，吳惺，等．單純性顱腦創(chuàng)傷患者凝血因子Ⅶ活性與凝血功能障礙和進(jìn)展性顱內(nèi)出血性損傷的相關(guān)性分析[J]．中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94(9)：688-691．

[4] Iacoviello L，Di Castelnuovo A，De Knijff P，et al．Polymorphisms in the coagulation factor Ⅶ gene and the risk of myocardial infarction[J]．N Engl J Med，1998，338(2)：79-85．

[5] Taylor KC，Lange LA，Zabaneh D，et al．A gene-centric association scan for Coagulation Factor Ⅶ levels in European and African Americans：the Candidate Gene Association Resource(CARe)Consortium[J]．Hum Mol Genet，2011，20(17)：3 525-3 534．

[6] Maguire JM，Thakkinstian A，Sturm J，et al．Polymorphisms in platelet glycoprotein 1balpha and factor Ⅶ and risk of ischemic stroke：a meta-analysis[J]．Stroke，2008，39(6)：1 710-1 716．

[7] Ito K，Goto K，Sugiura T，et al．Polymorphisms of the factor Ⅶ gene associated with the low activities of vitamin K-dependent coagulation factors in one-month-old infants[J]．Tohoku J Exp Med，2007，211(1)：1-8．

[8] Carew JA，Basso F，Miller GJ，et al．A functional haplotype in the 5' flanking region of the factor Ⅶ gene is associated with an increased risk of coronary heart disease[J]．Thromb Haemost，2003，1(10)：2 179-2 185．

[9] Pinotti M，Toso R，Girelli D，et al．Modulation of factor Ⅶ levels by intron 7 polymorphisms：population and in vitro studies[J]．Blood，2000，95(11)：3 423-3 428．

(收稿 2016-01-20)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81273175)

R651.1+5

A

1673-5110(2016)19-0038-03

△通訊作者：趙黎明，Email：zhaoliming1201@126.com