電針對高脂血癥新西蘭兔脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響

蘭彩蓮 薩喆燕 董亞琴 萬 隆 程佑民 鄭淑霞 許金森

(福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003)

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電針對高脂血癥新西蘭兔脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響

蘭彩蓮 薩喆燕 董亞琴 萬 隆 程佑民 鄭淑霞 許金森

(福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003)

目的 探討電針胃經(jīng)穴位對高脂血癥新西蘭兔血脂及脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)的影響。方法 取24只雄性新西蘭兔，隨機數(shù)字法分為高脂血癥組和正常對照組各12只。造模8 w以后，上述兩組再各自隨機分為電針組和對照組各6只。電針10 d后，7180型日立自動分析儀測定所有新西蘭兔的血脂四項，Real Time PCR法檢測新西蘭兔腹腔脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)。結(jié)果 造模后高脂血癥組的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)明顯高于正常對照組，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)明顯低于正常對照組(均P<0.05)，顯示造模成功。電針后高脂電針組的血清TC水平明顯低于高脂對照組(P<0.05)。電針后高脂電針組脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量明顯高于高脂對照組(P<0.05)。結(jié)論 電針新西蘭兔胃經(jīng)穴位可以有效降低血脂和增強脂肪組織脂聯(lián)素基因表達(dá)，對改善高脂血癥有一定作用。

高脂血癥；胃經(jīng)；電針；脂聯(lián)素

脂聯(lián)素是與代謝綜合征、肥胖、糖尿病和高脂血癥等疾病相關(guān)的蛋白，其含量變化可以為疾病的預(yù)后及治療提供參考。本實驗通過飲食造模營養(yǎng)性肥胖新西蘭兔，電針特定穴位后觀察新西蘭兔血脂和脂肪組織脂聯(lián)素基因表達(dá)情況，試圖從生化和分子層面為臨床電針療法獲得實驗證據(jù)的支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 主要儀器：7180型日立自動分析儀(日本日立公司)，7500 FAST型實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，ALLEGRA 64R型臺式高速冷凍離心機(美國貝克曼公司)，微量加樣槍(德國Eppendorf公司)，YLS-Q3多功能兔固定架(上海繼德教學(xué)實驗器械廠)，華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，華佗牌無菌針灸針(規(guī)格0.35 mm×25 mm，批號SD13A1105)。

主要試劑：Trizol試劑，異丙醇，乙醇，氯仿(廣州化學(xué)制劑廠)，RNA Store樣本保存液(TIANGEN公司)，SYBR Premix Ex Taq，ROX Reference Dye Ⅱ，脂聯(lián)素引物(TAKARA公司)，甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LCL-C)檢測試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：14100901)。

1.2 實驗動物 清潔級雄性新西蘭兔24只，體質(zhì)量(1.5±0.3)kg，上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2012-0011，飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥研究院動物房(普通級)，飼養(yǎng)溫度25℃～28℃，相對濕度50%～70%。實驗動物條件符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》要求。本實驗過程中對動物處置符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.3 飼料配制 基礎(chǔ)飼料和高脂飼料均委托廈門園泰生物科技有限公司合成。高脂飼料配方：10%豬油，10%蔗糖，1%膽固醇和79%基礎(chǔ)飼料。

1.4 動物分組和模型建立 24只新西蘭兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，采用隨機數(shù)字法分為高脂血癥組和正常對照組各12只。高脂血癥組給予高脂飼料喂養(yǎng)，正常對照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。以高脂血癥組和正常對照組血脂四項比較差異有顯著性意義作為判定模型成功的標(biāo)準(zhǔn)。飼喂8 w驗證造模成功后，高脂血癥組隨機分為高脂電針組和高脂對照組各6只，正常對照組隨機分為空白電針組和空白對照組各6只。高脂電針組和空白電針組電針10 d。高脂對照組和空白對照組在電針期間同法限制固定，不作電針干預(yù)。

1.5 電針干預(yù) 造模結(jié)束第2天開始給空白電針組和高脂電針組家兔施以每天每穴15 min電針刺激，將家兔穴位區(qū)1 cm×2 cm兔毛剪除，暴露局部皮膚組織，乙醇棉球消毒，用多功能兔固定架固定家兔，待家兔安靜不掙扎后進(jìn)行電針治療，使用無菌針灸針施灸于足三里穴(后肢背外側(cè)，脛骨粗隆下部外約0.3 cm處)〔1〕和豐隆穴(小腿中點處腓骨后緣，刺入腓骨長肌與趾長伸肌之間〔2〕)，電針參數(shù)：疏密波，頻率選擇2檔(20 Hz)，強度選擇1檔(1～2 V)，以新西蘭兔后肢出現(xiàn)抖動但不掙扎為度。電針期間空白對照組和高脂對照組以同樣方法抓取固定不做電針治療，電針療程為10 d。實驗期間所有家兔按照分組繼續(xù)高脂或普通飼料喂養(yǎng)。

1.6 血清和組織樣品收集

1.6.1 血清制備 分別于造模前后，電針療程前后禁食12 h，兔耳中央動脈采血4 ml，室溫下靜置后離心取血清，4 000 r/min離心15 min后分離上清液裝于1.5 ml離心管，保存于-80℃冰箱備測。

1.6.2 脂肪組織樣品制備 電針療程結(jié)束后第2天，空氣栓塞法處死所有新西蘭兔，解剖腹腔，小心剝離腹股溝處皮下脂肪組織，取材組織約0.5 cm×0.5 cm，裝于1.5 ml離心管，加入1 ml RNA Store樣本保存液后，迅速放入-80℃冰箱備測。

1.7 實驗指標(biāo)測定

1.7.1 血脂四項檢測 血清樣品恢復(fù)至室溫后，由7180型日立自動分析儀檢測TG、TC、HDL-C和LDL-C水平，采用對應(yīng)的血脂檢測試劑盒，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院檢驗科檢測。

1.7.2 脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)檢測 ①脂肪組織樣品解凍后，Trizol一步法提取總RNA。②用DNase I 消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA。用RNA純化試劑盒純化RNA，取RNA樣品2 μl經(jīng)Nanodrop2000超微量核酸蛋白測定儀測定RNA純度和濃度。RNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳1 h，在凝膠紫外透視儀下可觀察到清晰條帶，說明提取的RNA完整無降解。根據(jù)所測核酸濃度計算RNA樣品加入量，采用試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的反應(yīng)，引物序列正義：TGGGAGGAAATGCCAGTGTGT，反義：AAACAGGACTCAGCAAGAGCAAG。擴增產(chǎn)物長度為96 bp，委托TAKARA公司設(shè)計合成。③之后進(jìn)行Real Time PCR，將配置好的混合液加到PCR Array對應(yīng)的每個孔中，然后置PCR Array于實時定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，以上加樣操作均為冰浴上進(jìn)行。反應(yīng)體系：總體積25 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μl，上、下游引物各1 μl，ROXⅡ 0.5 μl，ddH2O 8 μl，cDNA 2 μl，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，每個樣本做3個復(fù)孔，用相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測基因表達(dá)RQ值。反應(yīng)條件：①預(yù)變性95℃30 s，②95℃3 s，60℃34 s，40個循環(huán)，③95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s。脂聯(lián)素mRNA表達(dá)量統(tǒng)計分析采用2-△△Ct法，正常對照組的數(shù)值均為1。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，所有定量數(shù)據(jù)組間比較采用同體對照t檢驗或者單因素方差，在方差齊性的情況下，兩兩比較采用LSD檢驗；在方差不齊的情況下，兩兩比較采用Dunnett′sT3檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 新西蘭兔造模前后體重和血脂對比 高脂飼料喂養(yǎng)8 w后，高脂血癥組體重、TG、TC，LDL-C明顯升高，HDL-C明顯降低(均P<0.05)，見表1，表2。高脂血癥組新西蘭兔血清呈乳糜混沌狀，肉眼觀察及數(shù)據(jù)比較均顯示高脂血癥造模成功。所有家兔無死亡，無脫落。

表1 高脂血癥組飼養(yǎng)8 w前后體重比較

與正常對照組造模后相比:1)P<0.001

表2 各組新西蘭兔造模前后血脂水平比較

與高脂血癥組造模前比較：1)P<0.05

2.2 新西蘭兔電針前后血脂水平對比 高脂電針組電針后TC水平〔(33.99±0.84)mmol/L〕較電針前〔(35.66±0.52)mmol/L〕明顯降低(P<0.05)，高脂對照組TC水平電針前〔(34.75±1.29)mmol/L〕與電針后〔(33.76±0.86)mmol/L〕無明顯差異(P>0.05)。

2.3 新西蘭兔電針后脂聯(lián)素mRNA表達(dá)對比 與高脂對照組比較，高脂電針組的脂聯(lián)素mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)?？瞻纂娽樈M與空白對照組脂聯(lián)素基因的表達(dá)未見顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 高脂血癥新西蘭兔電針后脂聯(lián)素 mRNA的表達(dá)比較

3 討 論

高脂血癥屬中醫(yī)“痰濕”“脂濁”范疇。高脂血癥的發(fā)生主要與脾胃肝膽失調(diào)，水谷精微生成及運化異常有關(guān)。痰濕體質(zhì)、濕熱體質(zhì)者因體內(nèi)濕濁不化、代謝不暢及濕濁困脾影響脾胃肝膽的運化和疏泄功能，因此更易罹患高脂血癥。豐隆及足三里穴均為足陽明胃經(jīng)之經(jīng)穴，同時豐隆為胃經(jīng)的絡(luò)穴，溝通脾經(jīng)，足三里為胃經(jīng)下合穴，主治胃腑病癥。豐隆穴祛痰化濁，足三里穴健脾化濕、通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和氣血，所以豐隆及足三里穴是針灸臨床處方中用以祛痰消瘀的首選穴位及主要配穴。

家兔作為草食性動物，其血漿脂蛋白譜與人相似，有膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白(CETP)、肝載脂蛋白(Apo)B100和腸ApoB48的表達(dá)，對外源性膽固醇吸收率較高，血中脂質(zhì)清除率較低。高脂飲食時，血漿TC、LDL-C、VLDL/TC顯著升高、HDL-C降低，易形成高脂血癥和動脈粥樣硬化(AS)病變。同時，家兔成模速度快，重復(fù)性好，成本低，是最早用于高脂血癥研究的動物。本次實驗造模結(jié)果良好，血脂水平較造模前有顯著性差異，是研究高脂血癥的理想動物模型。

樂薇〔3〕研究發(fā)現(xiàn)電針豐隆穴能降低高脂血癥大鼠TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，改善高脂狀態(tài)下血液濃、黏、聚、凝的高危險狀態(tài)，減少大鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥因子細(xì)胞間黏附因子(ICAM)-1、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6的含量，改善大鼠肝臟及主動脈弓形態(tài)學(xué)變化，有效抑制脂肪變性的發(fā)生程度，清除脂肪細(xì)胞，保護(hù)血管內(nèi)皮，減少脂質(zhì)沉積，對于As早期的血管壁具有一定的保護(hù)作用。電針豐隆穴通過提高膽固醇逆轉(zhuǎn)運通路兩個重要功能蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1(ABCA1)、清道夫受體BI(SR-BI)的表達(dá)，加速脂質(zhì)代謝，達(dá)到治療高脂血癥的目的，電針降脂作用效果確切。本研究也顯示電針特定穴位可顯著改善高脂血癥的高脂狀態(tài)，與上述研究相似。

目前對脂聯(lián)素的研究集中于肥胖、脂代謝異常、代謝綜合征、2型糖尿病及冠狀動脈疾病，在這些疾病中可見血清脂聯(lián)素濃度降低。電針可不同程度升高脂聯(lián)素的表達(dá)或血清濃度〔4〕。在脂聯(lián)素基因表達(dá)方面，孫志等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)針刺組脂聯(lián)素高表達(dá)，與正常組大鼠相似，模型組脂聯(lián)素表達(dá)很低。說明針刺具有顯著促進(jìn)2型糖尿病大鼠脂肪組織脂聯(lián)素基因表達(dá)的作用。以往研究亦證實，脂聯(lián)素在肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病時的表達(dá)下降，其血漿濃度也降低，甚至其降低的程度與胰島素抵抗和糖尿病的進(jìn)展相平行〔6〕。研究還表明，脂聯(lián)素血濃度與體質(zhì)指數(shù)(BMI)、體脂百分?jǐn)?shù)、腰/臀比、空腹胰島素和空腹TG呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C正相關(guān)〔7〕。機體內(nèi)環(huán)境可通過脂聯(lián)素與胰島素等激素間的“胰島素-脂聯(lián)素”調(diào)節(jié)環(huán)等的自身適應(yīng)性調(diào)節(jié)，使超重或輕度肥胖的患者基本保持了正常的血壓、血脂和血糖水平〔8〕。因此，脂聯(lián)素在高脂血癥的發(fā)生發(fā)展中負(fù)有相當(dāng)重要的角色，監(jiān)測其指標(biāo)對評價電針調(diào)脂治療方法的療效有重要意義。實驗結(jié)果顯示，電針刺激足三里和豐隆穴后，高脂血癥組新西蘭兔脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)上調(diào)，與韓志敏等〔9〕報道相似。本實驗還顯示高脂血癥組的TC水平顯著上升，推測電針可能通過上調(diào)脂聯(lián)素mRNA表達(dá)，激活脂肪細(xì)胞因子途徑，進(jìn)而通過特定通路(如肝臟Adiponectin/PPARɑ信號通路〔10〕)改善脂類代謝，發(fā)揮降低TC水平的效應(yīng)。

1 王春田.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗動物操作基本技能〔M〕.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009：136.

2 李忠仁.實驗針灸學(xué)〔M〕.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2006：243.

3 樂 薇.電針豐隆對高脂血癥模型大鼠膽固醇逆轉(zhuǎn)運通路的影響〔D〕.武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

4 嚴(yán)志康，楊智杰，陳 鋒.電針對高脂血癥大鼠血脂、超敏C反應(yīng)蛋白、脂聯(lián)素的調(diào)節(jié)作用〔J〕.針刺研究，2013；38(5)：365-8，85.

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9 韓志敏，侯玉鐸，閆麗萍，等.電針天樞等腹部腧穴對單純性肥胖大鼠血脂及血清脂聯(lián)素的影響〔J〕.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014；15(4)：15-7.

10 高品操，徐廣艷，常永娜，等.有氧運動聯(lián)合KGM對高脂膳食大鼠胰島素抵抗形成中肝臟Adiponectin/PPARɑ通路的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(2)：417-9.

〔2016-03-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effects of electroacupuncture on adiponectin mRNA expression in adipose tissue of New Zealand rabbits with experimental hyperlipidemia

LAN Cai-Lian,SA Zhe-Yan,DONG Ya-Qin,et al.

Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350003,Fujian,China

Objective To investigate the effect of electroacupuncture (EA) on Zusanli and Fenglong acupoint on lipid metabolism and adiponectin mRNA expression in adipose tissue of New Zealand rabbits with experimental hyperlipidemia.Methods 24 clean grade New Zealand rabbits were randomly divided into high lipid group and control group,12 rabbits in each group.All experimental hyperlipoidemia rabbits were fed by high fat diet for 8 weeks.Then either high lipid group or control group were randomly divided into blank control group and blank EA group,high lipid control group and high lipid EA group,6 rabbits in each group.Rabbits of blank EA group and high lipid EA group were electro-acupunctured for 10 days,while other groups fixed at the same time once per day.Blood was respectively collected from central auricular artery of rabbits before and after modeling,so as before and after treated by EA.All serum was separated.Four items of blood lipid were tested by 7 180 type Hitachi automatic analyzer.Adiponectin mRNA expression in adipose tissue was detected by Real-time PCR.Results ①The serum levels of TG,TC,LDL-C in rabbits fed by high fat diet were higher than those fed with normal diets(P<0.05).The serum levels of HDL-C were decreased in rabbits fed by high fat diet were higher than those fed with normal diets(P<0.05).The models were made successfully.②With treated by EA for 10 days,the serum levels of TC in rabbits of high lipid EA group decreased significantly(P<0.05),compared with high lipid control group.③The adiponectin mRNA expression is in adipose tissue of high lipid EA group increased significantly(P<0.05),compared with high lipid control group.Conclusions With EA at Stomach-meridian acupoints,the serum level of TC in hyperlipidemia rabbit is decreased and the adiponectin mRNA expression increased significantly,which can improve symptoms of hyperlipidemia to a certain degree.

Hyperlipidemia;Stomach meridian;Electroacupuncture;Adiponectin

國家自然科學(xué)青年基金項目(81403490)；福建省科技廳省屬公益類科研院所科研專項項目(2014R1035-8)；福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點研究室(2015)

許金森(1963-)，男，碩士生導(dǎo)師，研究員，主要從事中醫(yī)經(jīng)絡(luò)現(xiàn)代研究。

蘭彩蓮(1984-)，女，碩士，助理研究員，主要從事中醫(yī)經(jīng)絡(luò)現(xiàn)代研究。

R243

A

1005-9202(2016)20-4958-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.008