日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究

龍冬梅，黃 濤，湯德元，曾智勇，李 達(dá)，韋冠東

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究

龍冬梅，黃 濤，湯德元*，曾智勇，李 達(dá)，韋冠東

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

日本乙型腦炎是由日本乙型腦炎病毒引起的嚴(yán)重的人畜共患性傳染病，日本乙型腦炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括C、PrM和E 3種。其中C蛋白主要參與病毒RNA和蛋白之間的相互作用，且具有核定位信號序列，在乙腦病毒中，缺失此序列后C蛋白只在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)；PrM和E基因是其主要免疫保護(hù)性抗原基因，表達(dá)的蛋白是乙型腦炎病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒顆粒的主要成分，也是維持病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì)，主要參與病毒感染的后期階段，可誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫。近年來許多學(xué)者對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因原核表達(dá)和真核表達(dá)及其相關(guān)免疫原性進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的研究進(jìn)展，文章主要針對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為乙型腦炎基因工程疫苗的進(jìn)一步研究提供參考。

日本乙型腦炎病毒；結(jié)構(gòu)蛋白；原核表達(dá)；真核表達(dá)；免疫原性

日本乙型腦炎(Japanese encephalitis，JE)簡稱乙腦，是由乙型 腦炎病毒 (Japanese encephalitis virus，JEV) 引起的以三帶庫蚊為主要傳播媒介的嚴(yán)重的人畜共患傳染病。該病主要侵犯患病動(dòng)物或人的丘腦、脊髓、角細(xì)胞、大腦皮質(zhì)和小腦，引起患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷。動(dòng)物感染JEV的死亡率為30%，存活下來的有50%的動(dòng)物會(huì)有神經(jīng)系統(tǒng)的后遺癥［1］。世界衛(wèi)生組織（WHO）已經(jīng)把日本乙型腦炎列為重點(diǎn)防控傳染病。豬是乙型腦炎的主要傳染源，是引起母豬繁殖障礙的主要病原之一，對豬的致死率不高，臨床上以高熱和狂暴、或沉郁、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激等神經(jīng)癥狀為特征，具有明顯的季節(jié)性和一定的地理區(qū)域分布，多發(fā)生于蚊蟲較多的夏秋季節(jié)，屬于自然疫源性疾病，可引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎，也可引起公豬睪丸急性炎癥反應(yīng)或不育，因此，控制豬的乙腦具有十分重要的意義。隨著科技工作者對JEV分子結(jié)構(gòu)的大量研究，人們對JEV基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的蛋白等都有了較為清楚的認(rèn)識，為從分子水平上來研究JEV的防制奠定了理論基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，近年來許多學(xué)者對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因原核表達(dá)和真核表達(dá)及其相關(guān)免疫原性進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的研究進(jìn)展，本文主要針對日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為乙型腦炎基因工程疫苗的進(jìn)一步研究提供參考。

1 日本乙腦病毒的基因組結(jié)構(gòu)

JEV的基因組為單股正鏈RNA分子，其長度為11 kb，與其他黃病毒科成員相似，整個(gè)基因組由非編碼區(qū)(5'-noncoding region， 5'-NCR )和3’端的非編碼區(qū)(3'-NCR)和一個(gè)幾乎跨越整個(gè)基因組的單一開放閱讀框(open reading frame， ORF)構(gòu)成，無亞基因組結(jié)構(gòu)。5'端有一個(gè)I型帽子結(jié)構(gòu)，3’端無Poly ( A)尾，各基因之間無重疊。從5’端至3’端形成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白C(C)、膜蛋白( PrM/M )、囊膜糖蛋白(E)；7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1．NS2a．NS2b． NS3．NS4a．NS4b．NS5)，各基因在基因組上的排列為：5"-C-PrM/M-E-NSl-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3"，它們之間無重疊，JEV基因組結(jié)構(gòu)示意圖如圖1。

圖1 JEV基因結(jié)構(gòu)示意圖

2 JEV蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白與功能

JEV有3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM/M)和囊膜糖蛋白(E)，這些結(jié)構(gòu)蛋白是日本乙型腦炎病毒顆粒的主要成分，是維持病毒粒子形態(tài)結(jié)構(gòu)的主要物質(zhì)，編碼JEV結(jié)構(gòu)蛋白的這些基因定位于ORF5’端約前1/3的部分，結(jié)構(gòu)蛋白在N端順序依次為核衣殼蛋白C、膜蛋白PrM/ M和囊膜糖蛋白E，信號肽酶對此進(jìn)行至少3次切割，將這些結(jié)構(gòu)蛋白分開。JEV 3種結(jié)構(gòu)蛋白的功能分別為：

2.1 核衣殼蛋白C

核衣殼蛋白C的分子量為13 ku，屬于強(qiáng)堿性蛋白，由136個(gè)氨基酸組成，其39～54位氨基酸序列在黃病毒屬中具有保護(hù)性，且該段氨基酸序列具有疏水性［2］。C蛋白的保守性稍差，主要作用為C蛋白與基因組RNA結(jié)合組成核心，參與病毒RNA和蛋白之間的相互作用，將其暫時(shí)固定在宿主細(xì)胞的內(nèi)置網(wǎng)上，在病毒和衣殼裝配時(shí)發(fā)揮作用，作用是在合成部位由C端疏水性氨基酸將其暫時(shí)固定在宿主細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，以便裝配成核衣殼包裹基因組，保護(hù)基因組免受核酸酶或其他因素的破壞。

2.2 M蛋白

M蛋白是由其前體PrM切割而產(chǎn)生，分子量為8．5 ku，約含有75個(gè)氨基酸殘基，具有高度的疏水性，參與病毒囊膜的構(gòu)成，被包埋在病毒粒子囊膜的脂質(zhì)雙層中，它可能與插入脂雙層中的E蛋白完全疏水性C端相互作用。其前體蛋白PrM(18～19 ku)存在于感染細(xì)胞內(nèi)未成熟毒粒中，是未成熟病毒體的一部分，病毒以此與細(xì)胞相連。在病毒感染后期，可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，PrM蛋白緊密地與E蛋白結(jié)合在一起，形成異二聚體，其作用認(rèn)為是伴侶蛋白PrM對E蛋白的正確折疊、定位于膜上和最后的裝配起著至關(guān)重要的作用，是與膜結(jié)合以及裝配時(shí)所必須的，抑制病毒的作用直到病毒釋放。Takegami等［3］在對其生物學(xué)功能的研究中認(rèn)為：M蛋白參與病毒的感染過程，能誘生具有輕度中和作用的抗體。PrM區(qū)整體結(jié)構(gòu)相對較穩(wěn)定［4］，是病毒誘發(fā)保護(hù)性免疫的重要協(xié)同成分，對E蛋白的正確折疊、定位于膜上和最后的裝配十分重要。

2.3 包膜蛋白E

E蛋白是JEV主要的囊膜蛋白，也是毒粒表面最重要的成分，在JEV毒力中占有重要位置，分子量為53 ku，含有病毒血凝素中和抗原決定簇，為黃病毒屬中的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是引起宿主機(jī)體免疫及產(chǎn)生中和抗體的主要抗原蛋白，它在參與病毒粒子的吸附、穿入、致病和誘導(dǎo)宿主的免疫應(yīng)答等密切相關(guān)，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的中和抗體及其保護(hù)性免疫中起重要作用［5］，并且是體外中和作用中的主要靶位點(diǎn)和JEV特異性抗體的作用位點(diǎn)，一般認(rèn)為E蛋白是病毒受體的結(jié)合蛋白，介導(dǎo)膜融合和細(xì)胞傳入?；?yàn)閱挝稽c(diǎn)突變可使JEV病毒喪失其神經(jīng)毒力/侵襲力，通過對減毒株和野毒株的比較共有8個(gè)氨基酸殘基差異，具體位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315、E439位，是毒力減弱的關(guān)鍵位點(diǎn)，其中E138和E176位點(diǎn)上的氨基酸突變可能改變E蛋白對細(xì)胞受體的吸附性，或者引起該病毒對其他細(xì)胞不可穿透，這兩種機(jī)制導(dǎo)致病毒毒力減弱，即E蛋白138位點(diǎn)或138和176位點(diǎn)一起對乙型腦炎病毒強(qiáng)毒株在連續(xù)傳代過程中減弱起了關(guān)鍵作用［6］。同時(shí)E蛋白是體外中和作用的主要靶位點(diǎn)和JEV特異性抗體的作用位點(diǎn)，可激發(fā)中和抗體和保護(hù)性免疫。

3 日本乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原表達(dá)及其免疫的研究進(jìn)展

3.1 日本乙型腦炎的原核表達(dá)的研究進(jìn)展

Mason等［7］己成功地在大腸桿菌中表達(dá)JEV的 E蛋白，對其進(jìn)行單抗結(jié)合位點(diǎn)的研究。Konish等［8］用高度致弱的痘苗病毒NYVAC株分別構(gòu)建了VP908和VP923；VP908表達(dá)PrM、E和NS1， VP923表達(dá)PrM和E，用VP908和VP923免疫豬，能明顯降低JEV強(qiáng)毒株攻擊后的病毒血癥。

Wu等［9］將JEVCH2195LA分離株的E蛋白這段目的基因克隆到原核表達(dá)載體pET32a，然后在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白TrxD3，用純化的蛋白與弗氏佐劑或陽離子脂質(zhì)混合后免疫小鼠，結(jié)果證明：TrxD3融合蛋白能夠使小鼠產(chǎn)生較高的免疫保護(hù)中和抗體。

謝良伊［10］等根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中乙型腦炎病毒的PrM氨基酸序列獲得其對應(yīng)的基因序列，對PrM全長基因（80aa）進(jìn)行體外合成，將其克隆至Pet-21原核表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒Pet21-PrM，將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，通過鎳離子親和層析純化目的蛋白，將純化蛋白免疫BALB/c小鼠，獲取克隆抗體并利用Protein A Sepharose柱進(jìn)行純化，然后用ELISA法檢測抗體的效價(jià)，再用Western bolt法檢測抗體的特異性，最后獲得了高純度的乙型腦炎病毒PrM蛋白，并成功地制定了效價(jià)高達(dá)1：1．6×106特異性的單克隆抗體。

梅勻安等［11］提取JEV上海分離株的基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR擴(kuò)增該病毒的PrM基因片段，亞克隆到原核表達(dá)載體pET-28(a)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28(a)-JEV-prM并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取克隆擴(kuò)大培養(yǎng)3 h后，1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)3 h，分別在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后取樣，煮沸裂解細(xì)菌，SDS-PAGE檢測重組蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明獲得分子量為24 ku的重組蛋白，主要以包涵體形式表達(dá)，薄層掃描分析表明：表達(dá)量占總菌體蛋白的30%以上，純化后獲得高純度重組蛋白，占總蛋白60%以上。用純化蛋白His-JEV-prM免疫BALB/ c小鼠，制備了小鼠抗JEV-prM抗體，Western-blotting和間接免疫熒光檢測小鼠抗JEV-PrM抗體的特異性。純化蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高滴度抗體，并且該抗體能特異識別原核、真核和病毒表達(dá)的PrM。

徐健等［12］和湯德元等［13］將收集到的JEV貴州分離株（GZ株）根據(jù)GenBank登錄的JEVSA14和SA14-14-2株全基因序列設(shè)計(jì)并合成1對擴(kuò)增E基因的特異性引物，用RT-PCR方法擴(kuò)增出JEV貴州分離株E基因，并將E基因克隆到pET-32a-E(+）原核表達(dá)載體上，成功地構(gòu)建出了JEV的 E基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-E，將構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DH3）中，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western blot分析，得到了約59 ku條帶，與預(yù)期大小相符，進(jìn)一步提取、純化和濃縮目的蛋白，并將其加入弗氏佐劑后免疫小鼠，免疫后采血檢測抗體。結(jié)果顯示：JEV貴州分離株E基因原核表達(dá)目的蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定抗體水平。

3.2 日本乙型腦炎病毒的真核表達(dá)的研究進(jìn)展

Ashok M S等［14］構(gòu)建了編碼JEV E蛋白的DNA質(zhì)粒PCM XENV，經(jīng)鼻腔和肌肉途徑接種瑞士小鼠后，進(jìn)行JEV腦內(nèi)接種攻擊試驗(yàn)，結(jié)果顯示：該重組質(zhì)粒對攻擊感染有一定的保護(hù)作用。

Chen等［15］利用真核表達(dá)載體分別重組構(gòu)建了JEV E蛋白以及其他蛋白基因片段，通過比較上述重組質(zhì)粒在分別免疫動(dòng)物后所產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)與免疫保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)含JEV E蛋白編碼基因的質(zhì)粒DNA所致的中和抗體效價(jià)以及保護(hù)性免疫結(jié)果明顯優(yōu)于其他蛋白基因片段，用編碼JEV E蛋白的質(zhì)粒免疫小鼠，與活疫苗比較，結(jié)果產(chǎn)生了更持久更強(qiáng)的JEV E蛋白特異性抗體，且對JEV的致死具有高度保護(hù)性作用。

Konishi［16］利用DNA重組技術(shù)分別克隆了JEV E、C、NS1-2A、NS3以及NS5等蛋白編碼基因片段，發(fā)現(xiàn)含有JEV E蛋白編碼基因的質(zhì)粒DNA所致的中和抗體效價(jià)以及保護(hù)性免疫結(jié)果明顯優(yōu)于其他基因片段，說明含JEV E蛋白編碼基因的質(zhì)粒DNA免疫結(jié)果與前述E蛋白功能分析相符合，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和保護(hù)性免疫方面起著主要作用。研究還發(fā)現(xiàn)：含JEV PrME蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒DNA在免疫動(dòng)物后不僅誘導(dǎo)出特異性的CTL細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且還能產(chǎn)生特異性B細(xì)胞來參與體液反應(yīng)，通過進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)在免疫動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的中和抗體的效價(jià)與維持所需的時(shí)間都明顯高于普通滅活苗的免疫效果［17］。

Kour R等［18］用合成分泌型或膜錨定型JEV的P rM和E蛋白的質(zhì)粒經(jīng)肌注或基因槍接種小鼠發(fā)現(xiàn)：E蛋白的2種表達(dá)類型均能誘導(dǎo)較高的中和抗體滴度，而肌注較基因槍方法能誘導(dǎo)更高水平的抗E抗體反應(yīng)；認(rèn)為肌注可能誘導(dǎo)以Thl為主的免疫反應(yīng)，而基因槍接種誘導(dǎo)Th2為主的免疫反應(yīng)；在小鼠對JEV腦內(nèi)接種的攻擊感染可提供60%的保護(hù)。

馮國和［19］等提取JEV野生株JaGAr-01感染培養(yǎng)的C6/36細(xì)胞的總RNA，經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增出JEV prM/E與E基因片段，經(jīng)電泳和核酸測序后分別將它們的蛋白編碼基因片段構(gòu)建于真核表達(dá)載體pcDNA3的BamHI/EcoR I酶切位點(diǎn)之間，并分別將其命名為pJME和pJE。對培養(yǎng)后采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)，選用HepG2、COS-1、KN73細(xì)胞作為受體細(xì)胞，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pJME和pJE分別轉(zhuǎn)染于受體細(xì)胞，采用不同抗體系統(tǒng)，經(jīng)Western blot法檢測JEV prME和E蛋白的表達(dá)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在不同的細(xì)胞系內(nèi)，PrM/ E蛋白的表達(dá)優(yōu)于E蛋白。

4 對乙型腦炎病毒保護(hù)性抗原基因表達(dá)的展望

根據(jù)乙型腦炎病毒保護(hù)性基因的原核表達(dá)，抗原結(jié)合黃病毒C至E區(qū)段各結(jié)構(gòu)蛋白功能特點(diǎn)分析，人們發(fā)現(xiàn)在prM和E蛋白編碼基因所進(jìn)行的DNA疫苗具有一定的代表性。目前，國內(nèi)外應(yīng)用的乙腦疫苗主要有滅活疫苗和減毒疫苗2種。滅活疫苗主要是鼠腦純化滅活疫苗、和地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗。鼠腦純化滅活疫苗是從感染鼠腦培養(yǎng)制備的，由日本研制生產(chǎn)并得到國際廣泛認(rèn)可和使用的疫苗；地鼠腎細(xì)胞滅活疫苗為我國生產(chǎn)，病毒經(jīng)原代地鼠腎細(xì)胞培養(yǎng)制備的疫苗，1998年開始生產(chǎn)使用，隨后在全國大面積使用。近幾年，Vero細(xì)胞純化滅活疫苗已在研究生產(chǎn)，該疫苗主要是我國自主研制的乙腦SA14-14-2株，為目前唯一獲得認(rèn)可和推廣使用的乙腦活疫苗，自1989年獲得新藥證書以來，該疫苗產(chǎn)量不斷增多，并在全國廣泛使用，其弱毒性穩(wěn)定并己經(jīng)得到世界衛(wèi)生組織的認(rèn)可［20］；2000年曾明等對該減毒活疫苗進(jìn)行了基因組全序列測定，證明了它傳代后的穩(wěn)定性。隨著分子免疫學(xué)、分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展和生物技術(shù)的進(jìn)步和對JEV的分子生物學(xué)的大量研究，目前預(yù)防乙型腦炎病毒感染的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗，但由于滅活疫苗存在注射量大，需要多次注射，且效果不穩(wěn)定、免疫力不持久以及副作用大等缺點(diǎn)，所以減毒苗是一個(gè)更好的選擇；但是活疫苗畢竟是一種活的生物，所以我國研制的SA14-14-2株減毒活疫苗也會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)、帶毒、排毒、垂直傳播和核酸重組等現(xiàn)象，而且通過常規(guī)的血清學(xué)方法一般無法與自然感染區(qū)分開，所以基因工程苗是乙腦疫苗發(fā)展的方向，國內(nèi)外學(xué)者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗和亞病毒顆粒疫苗方面取得了一些進(jìn)展。如用乙腦SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黃熱病毒cDNA的相應(yīng)序列，構(gòu)建了嵌合的減毒乙腦疫苗，免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保護(hù)作用［20］?；蚬こ桃呙缬辛己玫陌l(fā)展前景，但有很多實(shí)際問題尚需解決。

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2016-01-28）

貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目（2015）。

龍冬梅（1990-），女，碩士研究生，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子病毒學(xué)的科研學(xué)習(xí)。

*通訊作者：湯德元（1964-），男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E-mail：tdyuan@163.com