荷葉總黃酮對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護作用

吳磊+司傳領+陳銘+薛琪+羅海青+朱翠玲+胡衛(wèi)成+王毓寧

摘要：為了探討荷葉總黃酮對H2O2誘導的PC12細胞損傷的保護作用及機制，建立以H2O2誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）為氧化應激損傷模型，通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法檢測正常細胞的存活率與損傷程度，用試劑盒測定不同濃度荷葉總黃酮對H2O2刺激PC12細胞中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活力、丙二醛（MDA）、蛋白質羰基含量的影響并檢測Caspase-3活力的變化；Real Time PCR檢測胞漿內Bcl-2與Bax的基因mRNA 的表達。結果表明荷葉總黃酮能顯著提高H2O2損傷的PC12細胞存活率，顯著減少H2O2刺激的PC12細胞中MDA與蛋白質羰基的生成，顯著提高CAT活性，但對提高SOD活性不顯著。PC12細胞損傷可增加凋亡相關蛋白Bax mRNA的表達，加入荷葉總黃酮后有降低作用；同時H2O2使Bcl-2 mRNA的表達降低，加入荷葉總黃酮后有提高作用。荷葉總黃酮在給藥濃度較低的情況下，對H2O2損傷的PC12細胞發(fā)揮著明顯的保護作用，其作用機制可能與抑制線粒體途徑的細胞凋亡有關。

關鍵詞：荷葉總黃酮；氧化應激；過氧化氫（H2O2）；PC12細胞；Caspase-3活力

中圖分類號： R284.1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0272-04

神經系統(tǒng)疾病（阿爾茨海默病、帕金森病和中風）的病理機制大多是由于氧化應激損傷神經元細胞造成的[1]。眾所周知，生物體在維持生命活動時，會產生必要的氧自由基，但是過量的氧自由基在體內堆積往往會造成脂質過氧化、蛋白質和DNA的氧化，以及防御系統(tǒng)如SOD、CAT和GPX等變化，這就會加速細胞的損傷或死亡。由于腦神經細胞膜通透性較高且富含多種不飽和脂肪酸，其氧代謝率極高，最終就會引起其抗氧化能力差，因此腦組織更易遭受自由基的損傷。尋找具有抗氧化應激作用的天然藥物對于治療神經系統(tǒng)疾病具有重要的臨床意義[2-4]。目前神經元細胞模型的建立大多采用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）損傷模型，這是因為PC12細胞無論在形態(tài)、結構和功能上，都具有與神經元細胞相似的諸多特征，且能與原代培養(yǎng)的神經細胞說明一致的問題[5]。

荷葉為睡蓮科多年生水生草本植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的葉子。先前的研究表明，荷葉在食用和藥用兩方面都具有較廣泛的應用，尤其作為一種減肥茶深受人們的喜愛，荷葉含有的黃酮類化合物為其主要的有效成分。荷葉總黃酮在生命現(xiàn)象中參與多種細胞活動，對其研究多集中在荷葉黃酮具有降脂減肥、抗自由基、抗氧化、抑菌、抗病毒、防衰老等多種生理活性上[6-10]，對其神經系統(tǒng)的保護作用未見報道。本研究以H2O2誘導的PC12細胞為模型，研究荷葉總黃酮對PC12細胞抗凋亡效果，探討荷葉總黃酮在氧化損傷相關疾病，如AD治療中應用的可能性，為更好地開發(fā)利用荷葉資源提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

荷葉于2013年采摘于江蘇省金湖縣，經中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所吳海峰博士鑒定為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）上的葉。

原大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞株PC12細胞，購買于美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）；RPMI-1640培養(yǎng)基、馬血清、胎牛血清購于Gibco公司；二甲基亞砜、臺盼藍、甲氮甲唑藍（MTT）購自Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（Ann Arbor，MI）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（碧云天）、蛋白質羰基含量測定試劑盒（Sigma-Aldrich）均購于碧云天生物研究所；過氧化氫（質量分數(shù)30%）為國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 主要儀器設備

CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO公司；Infinite M200 Pro型酶標儀，瑞士Tecan公司；超速冷凍離心機，Eppendorf公司；凈化工作臺；倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)等。

1.3 荷葉總黃酮提取及含量的測定[11]

1.3.1 荷葉總黃酮提取 采摘新鮮荷葉室溫陰干、粉碎后，稱取200 g荷葉粉末，按料液比1 ∶30，加入體積分數(shù)75%的乙醇水溶液熱回流提取，提取溫度為60 ℃，每次浸提2 h，共3次，提取液過濾后減壓濃縮定容至50 ml，此為荷葉總黃酮供試液。

1.3.2 蕓香苷標準曲線的制作[11] 用乙醇配制不同濃度的蕓香苷標準溶液（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL），各吸取1 mL 后加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，避光反應5 min，依次加入10%硝酸鋁0.3 mL，4%氫氧化鈉2 mL，混勻放置15 min 后，在波長510 nm處測定其吸光值。以蕓香苷濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制蕓香苷標準曲線。

1.3.3 荷葉總黃酮含量的測定 取供試液1 mL，按照標準曲線的測定方法，在510 nm處測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算荷葉中總黃酮提取率：

總黃酮提取率=C×N×Vm×100%。

式中：C為總黃酮質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為荷葉質量，g。

1.4 PC12細胞培養(yǎng)

用含5% 胎牛血清、10% 馬血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細胞，觀察細胞生長狀態(tài)，每3 d傳代1次。待細胞生長至融合率達80%時，用0.25%胰酶消化細胞，調整適當?shù)募毎芏冉臃N于細胞培養(yǎng)板進行各項指標測定。

1.5 荷葉總黃酮單獨給藥對正常PC12細胞的影響

取對數(shù)生長期細胞，計數(shù)后調整細胞數(shù)至5×104個接種于96孔板，培養(yǎng)16 h。加入不同濃度的荷葉總黃酮樣品0、20、40、80 g/mL組，每組設3個復孔。處理6 h后，吸去上清，每個孔加入20 μL的MTT工作液，于二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h，加入100 μL MTT終止液，完全溶解后，使用酶標儀于550 nm 處測定吸光度，計算細胞生長率。

1.6 荷葉總黃酮對PC12細胞凋亡率的影響

取對數(shù)生長期細胞，計數(shù)后調整細胞數(shù)至5×104個接種于96孔板，培養(yǎng)16 h。分別設正常組（不加藥物正常培養(yǎng)的細胞），石榴籽油0.5、1、2、4 mg/mL組，同時設無細胞的空白對照組，每組設3個復孔。細胞接種0.5 h后，加入H2O20.5 mmol/L。處理6 h后，吸去上清，每個孔加入20 μL的MTT工作液，于二氧化碳培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4 h，加入100 μL MTT終止液，完全溶解后，使用酶標儀于550 nm處測定吸光度，計算細胞生長率。

1.7 荷葉總黃酮對氧化應激的PC12細胞中SOD、CAT活力以及MDA、蛋白質羰基含量的影響

取對數(shù)生長期PC12細胞，計數(shù)后每孔接種6×105個細胞于6孔板，培養(yǎng)16 h后，加入不同濃度的樣品溶液，0.5 h后，加入H2O2處理6 h，吸去上清，完成給藥及H2O2處理后，采用細胞刮徹底收集細胞，用預冷的PBS洗滌，超聲破碎細胞，4 ℃下8 000 r/min離心15 min，收集上清液按照試劑盒方法測定細胞勻漿中SOD、CAT活力及MDA、蛋白質羰基含量。

1.8 Caspase-3活力檢測

取對數(shù)生長期PC12細胞，每孔接種1×106個細胞于6孔板，培養(yǎng)16 h后，倒掉舊培養(yǎng)基，加入不同濃度的樣品溶液，0.5 h后，加入濃度為0.5 mmol/L H2O2處理6 h，吸去上清，采用預冷的PBS沖洗細胞并將細胞刮入離心管中，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，將上清棄掉，收集的細胞按照試劑盒方法測Caspase-3 活力。

1.9 PC12細胞Bax和Bcl-2 mRNA 表達變化檢測（real time RT-PCR）

取對數(shù)生長期PC12細胞，接種3×106個細胞于4 mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h后，倒掉舊培養(yǎng)基，設置空白組、對照組，向樣品組加入不同濃度的樣品溶液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min后，加入濃度為0.5 mmol/L H2O2培養(yǎng)6 h，按照 TRIzol 法提取細胞總RNA進行濃度測定，D260 nm/D280 nm鑒定純度，跑RNA膠看是否降解。取2 μg RNA反轉錄成cDNA后PCR擴增。Bax的引物序列為上游：5′-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3′，下游：5′-GAGGAAGTCCAGTGTCCAGC-3′；Bcl-2引物序列為上游：5′-ATCTTCTCCTTCCAGCCTGA-3′，下游：5′-TGCAGCTGACTGGACATCTC-3′；GAPDH的引物序列為上游：5′-CACTCACGGCAAATTCAACGGCA-3′，下游：5′-GACTCCACGACATACTCAGCAC-3′。反應體系及條件：25 μL預混合Ex Taq，cDNA 4 μL，1 μL熒光染料，上、下游引物各1 μL 以及9 μL蒸餾水混合后置入96孔板中。94 ℃預變性10 min；94 ℃變性15 s，55 ℃復性15 s，72 ℃延伸30 s，擴增30個循環(huán)；72 ℃延伸1 min后，進行光密度積分值分析，與內參照GAPDH產物的光密度積分值之比作為相對含量值。

1.10 統(tǒng)計學分析

所有試驗均重復3次，各試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 荷葉總黃酮含量測定

荷葉中除了含有碳水化合物、脂質、蛋白質等常規(guī)成分外，還富含大量的黃酮類化合物，根據(jù)蕓香苷標準曲線y=0.003x-0.013 9，r=0.999 9，求得荷葉中總黃酮提取率為5.64%（干荷葉）。這比葉思平報道的超聲提取荷葉所得總黃酮的得率為10.55%要低[12]，可能是和提取時間與提取方式有關。

2.2 荷葉總黃酮單獨給藥對正常PC12細胞的影響

荷葉總黃酮各劑量組（20、40、80 μg/mL）預孵育6 h后細胞存活率分別為（103.21±11.65）%、（98.12±9.23）%和（95.43±13.65）%，正常對照組細胞存活率為（100±17.36）%，各給藥組與對照組相比沒有顯著性差異（P>0.05），如圖1所示，表明荷葉總黃酮本身對正常PC12細胞沒有損傷。

2.3 不同濃度荷葉總黃酮對PC12細胞凋亡率的影響

如圖2所示，與正常對照組相比，H2O2模型組細胞存活率為（38.45±13.21）%，加入20、40、80 μg/mL的荷葉總黃酮后，其細胞存活率分別為（43.45±9.12）%、（67.43±9.12）%和（78.45±21.34）%。結果表明，與模型組相比受試藥組細胞凋亡比率明顯降低，且存在劑量依賴關系，荷葉總黃酮具有抑制H2O2誘導PC12細胞損傷的作用。

2.4 荷葉總黃酮對過氧化氫損傷的PC12細胞中SOD、CAT活力以及MDA、蛋白質羰基含量的影響

由圖3可見，加入H2O2后，與空白對照組相比，細胞培養(yǎng)液中MDA與蛋白質羰基含量明顯升高，CAT與SOD活性降低，細胞存活率降低，荷葉總黃酮處理后，CAT活性隨著給藥濃度的增大而升高。MDA與蛋白質羰基含量隨著給藥濃度的升高而降低，但是SOD活性隨著給藥濃度的升高變化不大。說明荷葉總黃酮達到保護過氧化氫損傷細胞的作用可能與CAT有關。

2.5 [JP4]荷葉總黃酮對H2O2損傷PC12細胞Caspase-3活性的影響

試驗結果表明，與對照組相比，模型組中活化的Caspase-3水平升高；與模型組相比，荷葉總黃酮（20、40、80 μg/mL）試驗組的Caspase-3水平均有不同程度的降低，且荷葉總黃酮對Caspase-3活性降低的作用具有劑量依賴性（圖4）。試驗結果表明，荷葉總黃酮抗凋亡作用可能與其調節(jié)Caspase級聯(lián)反應的激活有關。

2.6 荷葉總黃酮對H2O2損傷PC12細胞Bax和Bcl-2mRNA 表達的影響

以GAPDH為內參照， 正常對照組Bax和Bcl-2 mRNA的表達為100%，其他各組與其比較得百分比。結果表明，H2O2損傷組PC12細胞Bcl-2 mRNA的表達水平比正常對照組降低。預先不同濃度荷葉總黃酮保護后Bcl-2 mRNA的表達較H2O2損傷組增加，而Bax mRNA的表達為H2O2損傷組比正常對照組升高，給藥保護后Bax mRNA的表達顯著減小。

3 結論

本研究中，PC12細胞經過H2O2處理后，細胞存活率下降，MDA與蛋白質羰基含量明顯升高，CAT與SOD活性降低；經過荷葉總黃酮預處理后各項指標均有逆轉，細胞存活率提高，MDA與蛋白質羰基含量降低，CAT活性提高，表明荷葉總黃酮對H2O2誘導的PC12細胞損傷具有明顯的保護作用。經過給藥處理后，其SOD活性并無顯著變化，這就不能有效地清除自由基，可以推測荷葉總黃酮活性組分進入細胞后阻止H2O2介導的氧化損傷所起的作用不顯著。

研究表明，氧化應激能夠觸發(fā)線粒體通路的細胞凋亡，Bcl-2家族中的蛋白在此通路中發(fā)揮著重要的作用。其中包括促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2。Bcl-2/Bax的比例被認為是確定細胞是存活還是死亡的關鍵因素，包括PC12細胞。已經被證實Bcl-2與Bax可能通過控制線粒體膜滲透性變化，從而促進細胞色素c的釋放，最終導致Caspase-3的級聯(lián)反應引起細胞的凋亡[13-14]。本試驗研究表明，用H2O2處理后能夠降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達量而提高促凋亡蛋白Bax表達量，而加入荷葉總黃酮后，其變化正好相反，即Bcl-2/Bax二者比例較之模型組提高，說明荷葉總黃酮通過調節(jié)Bcl-2和Bax的表達來實現(xiàn)對H2O2損傷PC12細胞凋亡的保護作用，同時進一步證明荷葉總黃酮對PC12細胞保護作用與細胞凋亡線粒體通路相關。

細胞凋亡過程與一系列的生物化學變化有關，這其中包括Caspase家族蛋白的激活，Caspase-3作為細胞凋亡程序中最下游的調控蛋白，對細胞凋亡起著關鍵的作用[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)模型組中H2O2能夠提高Caspase-3活性程度，但是當加入不同濃度的荷葉總黃酮后，Caspase-3活性明顯降低。這充分說明了荷葉總黃酮通過抑制Caspase-3的活化而最終達到對H2O2損傷的PC12細胞的保護作用。

綜上所述，荷葉總黃酮可能通過提高抗凋亡蛋白Bcl-2表達，降低促凋亡蛋白Bax表達，最終導致Caspase-3的級聯(lián)反應有效地抑制H2O2誘發(fā)的PC12細胞凋亡，產生良好的神經元保護作用。本研究為揭示荷葉總黃酮的作用靶點提供了思路，為進一步的研究闡明了其作用機制。

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