誘導(dǎo)茄子花藥通過胚胎發(fā)生途徑再生植株

杜碧云+崔慧琳+崔群香+周顯忠+張?zhí)煊?吳飛澤+何成榮

摘要：以9份茄子花藥為試材進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，茄子花藥培養(yǎng)能通過胚胎發(fā)生途徑再生出植株；9份材料均誘導(dǎo)產(chǎn)生了胚狀體，但不同材料胚狀體誘導(dǎo)頻率存在差異，15-黑冠誘導(dǎo)率最高，為17%；91個(gè)胚狀體中，12個(gè)萌發(fā)成植株，萌發(fā)率為13%；12個(gè)植株中，7株移栽成活并現(xiàn)蕾開花，其中5株為單倍體，1株為二倍體，1株為四倍體；雖然2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上花藥膨大率高于1號(hào)培養(yǎng)基上的花藥，但后者隨后會(huì)產(chǎn)生更多成熟且發(fā)育一致的胚胎。結(jié)果表明，如何促使胚狀體發(fā)育成熟、提高單倍體加倍頻率、確定胚狀體的細(xì)胞起源，是制約茄子花藥育種實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

關(guān)鍵詞：茄子；花藥；胚胎發(fā)生；植株再生

中圖分類號(hào)： S641.104+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0192-04

植物花藥和花粉（小孢子）培養(yǎng)是生產(chǎn)單倍體和雙單倍體的有效手段，在育種研究中可以大大縮短育種年限。自Guha（1964）和Maheshwar（1982）利用毛葉蔓陀羅（Datura innoxia）進(jìn)行花藥培養(yǎng)獲得胚狀體及其再生植株后，至今已有200多種植物通過花藥培養(yǎng)獲得了再生植株[1]。茄子（Solanum melongena L.）花藥培養(yǎng)的研究開始于 20世紀(jì)70年代初[2]，從那以后從花藥和花粉培養(yǎng)均成功獲得了單倍體植株[3]。茄子花藥和花粉培養(yǎng)中，再生植株多數(shù)經(jīng)由愈傷組織通過器官發(fā)生途徑獲得[4-9]，少數(shù)報(bào)道茄子能夠通過胚胎萌發(fā)產(chǎn)生植株[10-12]。研究表明，茄子花藥培養(yǎng)能夠獲得花粉細(xì)胞起源的再生植株，再加上茄子花粉培養(yǎng)常需從預(yù)培養(yǎng)的花藥中游離小孢子培養(yǎng)，整個(gè)過程比花藥培養(yǎng)技術(shù)更加復(fù)雜，因此國內(nèi)茄子單倍體技術(shù)育種研究者以花藥培養(yǎng)研究為主。

本研究以金陵科技學(xué)院茄子育種課題組所收集的優(yōu)異茄子花藥為材料，開展培養(yǎng)，以期獲得花粉起源的植株，建立穩(wěn)定可靠的茄子花藥培養(yǎng)再生體系，為創(chuàng)制茄子遺傳育種新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為金陵科技學(xué)院蔬菜育種組收集的茄子8個(gè)商品種的低世代自交系，1個(gè)F1代品種聚合雜交的后代，以及田間生長的不知名品種的植株。材料編號(hào)分別為14-24、14-25、14-55、14-84、15-231、15-232、15-234、15-黑冠、15-混雜。14-24、14-25、14-55、14-84為2013年底育苗，2014年種植；其余材料為2014年底育苗，2015年種植；所有植株春季栽培結(jié)束后，在8月份剪枝再生。定植植株或剪枝再生植株現(xiàn)蕾開花后，選取花瓣距離花萼裂片±2 mm的未開放花蕾進(jìn)行花藥培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 花蕾采集和消毒

采取符合標(biāo)準(zhǔn)的花蕾，在4 ℃冰箱中保濕條件下低溫處理1～2 d后取出，整理后去除花萼裂片，按常規(guī)方法在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒，先用75%乙醇浸泡2 min，再用6.5%次氯酸鈉加入1滴吐溫-80震蕩消毒15 min，最后用無菌水清洗4～5次。

1.2.2 花藥培養(yǎng)

消毒處理后的花蕾，放在無菌濾紙上，用鑷子和剪刀剝?nèi)テ渲械幕ㄋ帲臃N到預(yù)處理培養(yǎng)基中，先在36 ℃ 條件下暗培養(yǎng)6 d，然后將未出現(xiàn)污染的花藥轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在25 ℃℃、光周期16 h/8 h的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，20 d后轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基中，每20 d繼代1次，直至出現(xiàn)愈傷組織或胚狀體，將發(fā)育較充分的胚胎及時(shí)轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基中，分化和生根培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中調(diào)查花藥膨大率和胚胎發(fā)生的頻率。

基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基并加以改良，添加不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑形成預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，pH值為5.8，121 ℃，在0.1～0.15 MPa 壓力進(jìn)行滅菌15 min。培養(yǎng)基具體配方如下：

（1）預(yù)處理培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L 2，4-D+8.0 mg/L 維生素C+1.0 mg/L KT+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉；

（2）誘導(dǎo)培養(yǎng)基1：MS+2.0 mg/L KT+10 g/L聚乙二醇（PEG-4000）+15 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉； 誘導(dǎo)培養(yǎng)基2：MS+1.0 mg/L BA+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L KT+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂粉；

（3）胚狀體分化培養(yǎng)基：MS+0.1 mg/L NAA+2 mg/LZT+800 mg/L Glu+30 mg/L GSH+100 mg/L L-Ser+30 g/L 蔗糖+8 g/L瓊脂粉；

（4）生根培養(yǎng)基：1/2MS+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖+8 g/L 瓊脂粉。

1.2.3 再生植株開花結(jié)實(shí)性和倍性鑒定

煉苗移栽前，從每個(gè)試管苗上剪取3～4條長3～4 cm的根，或現(xiàn)蕾開花時(shí)采取小花蕾，將根或花蕾用卡諾固定液固定24 h，系列濃度的乙醇清洗后，放在75%乙醇中保存?zhèn)溆?。采用根尖染色體計(jì)數(shù)或花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察法鑒定植株的倍性，根尖或花蕾用卡寶-品紅染液染色，壓片法制片，并用Nikon80i顯微鏡在可見光下觀察和拍照。根據(jù)根尖染色體數(shù)目或減數(shù)分裂各時(shí)期染色體數(shù)目，結(jié)合開花結(jié)實(shí)情況，確定植株的倍性。開花后觀察各植株花朵的大小、花粉的有無以及能否結(jié)實(shí)，并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥培養(yǎng)胚胎發(fā)生和再生植株的過程

剛接種的花藥為淡綠色（圖1-1），經(jīng)過熱處理后，多數(shù)花藥保持原來的形態(tài)，顏色由淡黃綠色變?yōu)闇\褐色，部分花藥周圍的培養(yǎng)基上出現(xiàn)污染的菌斑（圖1-2）；花藥轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上以后，部分花藥仍舊保持原來的形態(tài)，部分花藥開始膨大（圖1-3），由殘存花絲產(chǎn)生的愈傷組織致密，而疏松的愈傷組織往往從花藥中部或遠(yuǎn)離花絲的花藥端產(chǎn)生，并且能夠產(chǎn)生胚胎的花藥多數(shù)也能產(chǎn)生疏松的愈傷組織（圖1-4）。花藥在轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)約2周后產(chǎn)生胚胎，一般1枚花藥會(huì)產(chǎn)生0～3個(gè)胚狀體（圖1-5），最多時(shí)1枚花藥可以產(chǎn)生7個(gè)胚狀體（圖1-6），胚狀體發(fā)育不同步，成熟的胚狀體子葉、胚根和根毛結(jié)構(gòu)清晰。胚狀體轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后，多數(shù)褐化或重新愈傷組織化（圖1-7），少數(shù)成熟的胚狀體能夠萌發(fā)，經(jīng)2后左右長成小苗（圖1-8）。

2.2 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)胚胎發(fā)生的影響

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)只有在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上發(fā)生膨大的花藥才能最終產(chǎn)生愈傷組織和胚胎，對(duì)花蕾數(shù)量較多、消毒效果較好材料是15-231、15-232，進(jìn)行了2種誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)花藥膨大效果的試驗(yàn)，每品種每培養(yǎng)基接種10皿，每皿內(nèi)接種17～21枚花藥，誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)計(jì)膨大率（每皿膨大花藥數(shù)/每皿接種花藥數(shù)×100%），并進(jìn)行方差分析。結(jié)果（表1）表明，不同品種的花藥膨大率沒有顯著差異，品種與培養(yǎng)基之間不存在顯著的互作效應(yīng)，但2種誘導(dǎo)培養(yǎng)基之間膨大率存在顯著差異，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基2中的花藥膨大率平均為77.45%，顯著大于誘導(dǎo)培養(yǎng)基1中的68.29% 。

2.3 不同基因型材料胚胎發(fā)生頻率

花藥轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基后，約有半數(shù)花藥能夠產(chǎn)生愈傷組織，少數(shù)的花藥能夠產(chǎn)生胚狀體，由于繼代過程中仍舊會(huì)出現(xiàn)污染，無法精確地依據(jù)品種和誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及膨大花藥來統(tǒng)計(jì)各材料的胚胎發(fā)生頻率，只能根據(jù)各品種最初接種的花藥總數(shù)以及最終出現(xiàn)的胚狀體數(shù)統(tǒng)計(jì)不同品種的出胚頻率。所有供試品種在培養(yǎng)過程中均出現(xiàn)了胚狀體，但頻率不同，15-黑冠出胚頻率最高，為17.0%；其次是15-231，頻率為16.7%；15-234、15-232出胚頻率均低于1%（表2），說明基因型影響花藥胚胎發(fā)生頻率。胚胎轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上以后，僅有14-55、14-84、15-231、混雜材料的胚胎萌發(fā)形成現(xiàn)蕾開花的植株。

2.4 再生植株倍性及性狀觀測

試驗(yàn)過程中出現(xiàn)的胚狀體，分次轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后，多數(shù)褐化死亡，或者重新愈傷化，轉(zhuǎn)入調(diào)整生長調(diào)節(jié)劑濃度和種類的各種誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基后，沒有成功誘導(dǎo)出芽和植株，而少數(shù)發(fā)育成熟的胚狀體則能夠直接萌發(fā)形成植株，最終獲得了萌發(fā)的小植株12株，移栽成活并開花的植株7株，還有2株正待移栽，其余3株則在移栽過程中死亡。

成活的植株經(jīng)過根尖染色體數(shù)目和減數(shù)分裂過程中二分體（中期Ⅱ）染色體數(shù)目鑒定，確定了植株的倍性：5株為單倍體，1株為二倍體，1株為四倍體。單倍體、二倍體、四倍體植株均能開花，個(gè)別單倍體花朵能夠產(chǎn)生少量花粉，但所有單倍體植株自交均不結(jié)實(shí)（圖2-1至圖2-4）；二倍體植株則能夠開花，并自交結(jié)實(shí)，已獲得自交種子（圖2-5至圖2-8），該二倍體植株的花粉給系譜法選育出的茄子二倍體自交系授粉也能結(jié)子；四倍體植株則能開花散粉，已經(jīng)自交結(jié)實(shí)（圖2-9至圖2-12）。

3 結(jié)論與討論

影響茄子花藥培養(yǎng)的因素很多，包括花蕾預(yù)處理、基本培養(yǎng)基種類、花蕾生理狀態(tài)、花粉發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基中激素種類及其配比、活性碳和硝酸銀的添加等等[3，13-15]，茄子花藥培養(yǎng)多用MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基[16]，適宜進(jìn)行花藥培養(yǎng)的茄子花蕾特征為花瓣長與花蕾萼裂基部之差在 0～2 mm[17]，采用先低溫后高溫的變溫處理[18]，進(jìn)行培養(yǎng)容易取得成功。本研究在前人工作的基礎(chǔ)上，采用MS基本培養(yǎng)基，選用花瓣長與花蕾萼裂基部之差在 0～2 mm的花蕾，對(duì)花藥先低溫預(yù)處理12～48 h，再在36 ℃下處理6 d，隨后在25 ℃下恒溫培養(yǎng)，最終獲得了愈傷組織和胚狀體，并通過胚狀體直接萌發(fā)產(chǎn)生了植株，進(jìn)一步驗(yàn)證了前人的研究成果。通胚胎發(fā)生的方式，從花藥培養(yǎng)到產(chǎn)生成熟胚狀體，最早僅需42 d，胚狀體萌發(fā)產(chǎn)生的植株半年內(nèi)開花，二倍體和四倍體能夠形成自交株系。與種子播種到開花結(jié)實(shí)采子所需時(shí)間一致，比通過愈傷組織器官發(fā)生途徑產(chǎn)生植株時(shí)間更短，效率更高。

宋彥平等研究發(fā)現(xiàn)，茄子在盛花期，采摘的適宜花蕾胚誘導(dǎo)率最高，始花期次之，末花期最低[7]。本研究中所采用的花蕾，既有來源于春季栽培而秋季剪枝再生的植株，也有當(dāng)年春季定植后生長中各個(gè)時(shí)期植株上的花蕾，而以剪枝再生植株上的花蕾培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體更多，胚狀體更易發(fā)育成苗。劉獨(dú)臣等在研究中發(fā)現(xiàn)，茄子花藥產(chǎn)生胚狀體受基因型影響，其所采用的10個(gè)品種，只有2個(gè)品種產(chǎn)生了胚狀體，最高胚胎誘導(dǎo)率為18%[14]。而本試驗(yàn)中所采用的9份材料均再生出了胚胎，2份材料的最高出胚率也接近18%，但最低的則只有0.5%，與劉獨(dú)臣等的研究結(jié)果[12]基本一致，但基因型反應(yīng)頻率更高，可能與選用材料遺傳背景不同有關(guān)。

本研究中共獲得了91個(gè)比較大的茄子狀體，前期獲得的胚狀體由于培養(yǎng)條件和配方不合適等原因，多數(shù)褐變死亡，或愈傷化后不再分化出不定芽，最終無法形成完整植株，后期經(jīng)過改進(jìn)，尤其是通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方、改進(jìn)培養(yǎng)條件，已經(jīng)能使更多的成熟胚狀體直接發(fā)育成植株，最終使12個(gè)胚狀體成苗。

聚乙二醇為長鏈乙醇聚合物，水溶性好，在溶液中不分解為離子，是一種較為理想的水勢調(diào)節(jié)劑，被廣泛應(yīng)用作滲透調(diào)節(jié)劑[19-20]，研究人員在進(jìn)行茄子花藥直接游離小孢子培養(yǎng)時(shí)，將培養(yǎng)基中的一半碳源用聚乙二醇代替后誘導(dǎo)出了更多的胚狀體[9]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雖然誘導(dǎo)培養(yǎng)基2誘導(dǎo)花藥膨大頻率顯著高于誘導(dǎo)培養(yǎng)基1，但產(chǎn)生胚狀體最多的花藥是從誘導(dǎo)培養(yǎng)基1轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上的花藥（圖1-6），且 7個(gè)胚胎發(fā)育基本一致。2種培養(yǎng)基的差別在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基1中添加了聚乙二醇，是否因聚乙二醇的添加而促使茄子花藥和花粉培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體同步發(fā)育并成熟，需要進(jìn)一步深入研究。

植株的加倍技術(shù)[21]是制約單倍體植株保存和利用的關(guān)鍵，筆者參照北京市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜所單倍體組[11]的方法，對(duì)獲得的單倍體植株進(jìn)行了加倍處理，但未加倍成功，如何提高茄子單倍體植株加倍頻率有待于進(jìn)一步研究。

鄧立平等通過花藥培養(yǎng)獲得了加倍單倍體植株，并用于茄子新品種選育[22]，本試驗(yàn)中得到的茄子二倍體和四倍體植株能否用作選育雜交種品種的親本，還需要進(jìn)一步鑒定所獲得的胚狀體是配子起源還是體細(xì)胞起源。

參考文獻(xiàn)：

[1]王延玲，豐 震，趙蘭勇. 植物花藥培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，37（1）：149-151.

[2]Raina S K，Iyer R D. Differentiation of diploid plants from pollencallus in anther cultures of Solanum melongena L.[J]. Journal of Plant Breeding，1973，70（4）：275-280.

[3]齊衛(wèi)強(qiáng)，郭玲娟，孫治強(qiáng). 茄子花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（12）：4929-4931.

[4]顧淑榮. 茄子（Solanum melongena L.）花粉粒離體培養(yǎng)獲得植株[J]. 植物學(xué)報(bào)，1979，21（1）：31-35.

[5]Miyoshi K. Callus induction and plantlet formation through culture of isolated microspores of eggplant （Solanum melongena L.）[J]. Plant Cell Reports，1996，15（6）：391-395.

[6]連 勇，劉富中，陳鈺輝，等. 茄子體細(xì)胞雜種游離小孢子培養(yǎng)獲得再生植株[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2004，31（2）：233-235.

[7]宋彥平，申書興，王彥華，等. 茄子游離小孢子培養(yǎng)獲得愈傷組織的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（3）：32-35.

[8]朱朝輝，鐘開勤，黃建都，等. 茄子游離小孢子培養(yǎng)初探[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（10）：1883-1887.

[9]Corral-Martínez P，Seguí-Simarro J M. Efficient production ofcallus-derived doubled haploids through isolated microspore culture in eggplant （Solanum melongena L.）[J]. Euphytica，2012，187（1）：47-61.

[10]北京市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所單倍體育種組，中國科學(xué)院北京植物研究所五室形態(tài)組.茄子（Solanum melongena L.）花藥培養(yǎng)的研究[J]. 植物學(xué)報(bào)，1975，17（4）：323-325.

[11]北京市農(nóng)科院蔬菜所單倍體組.茄子花藥培養(yǎng)和加倍技術(shù)的研究[J]. 農(nóng)業(yè)新技術(shù)，1977（5）：38-41.

[12]劉獨(dú)臣，房 超，李躍建，等. 茄子花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體成苗[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（6）：1643-1646.

[13]馬 欣，申書興，連 勇，等. 茄子花藥和游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 長江蔬菜，2006（7）：39-41.

[14]劉獨(dú)臣，房 超，劉小俊，等. 茄子花藥培養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 長江蔬菜，2006（7）：42-44.

[15]李文澤，胡 含. 在花藥花粉培養(yǎng)中預(yù)處理的作用機(jī)理[J]. 遺傳，1995（增刊1）：13-18.

[16]Kumar S，Singh M，Prabhavathi K，et al. In vitro induction of haploid in eggplant（Solanum melongena L.） [J]. Capsieum and Eggplant Newsletter，2003，22：147-150.

[17]馬 欣. 茄子游離小孢子培養(yǎng)及其形態(tài)發(fā)育學(xué)觀察[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[18]Rotino G L，F(xiàn)alavigna A，Restaino F. Production of anther-derived plantlets of eggplant[J]. Capsicum News Letter，1987（6）：89-90.

[19]張 霽，趙青紅，郭蘭萍，等. 聚乙二醇的滲透調(diào)節(jié)作用在藥用植物育種研究中的應(yīng)用[J]. 中草藥，2010，41（8）：1399-1403.

[20]馮艷秋，岳 樺. PEG-6000模擬干旱脅迫對(duì)朝鮮落新婦的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（5）：184-187.

[21]王玉英，李光宏，李志敏，等. 野生黃蟬蘭多倍體誘導(dǎo)初報(bào)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：132-134.

[22]鄧立平，郭亞華. 茄子花藥培養(yǎng)及單倍體育種[J]. 生物技術(shù)，1991（5）：30-34.