海島棉抗枯萎病相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量PCR分析

杜榮光，姚正培，陳全家，張杰，杜麗麗，蘇秀娟，曲延英

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830052)

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海島棉抗枯萎病相關(guān)基因?qū)崟r熒光定量PCR分析

杜榮光，姚正培，陳全家，張杰，杜麗麗，蘇秀娟，曲延英

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830052)

【目的】以不同抗性海島棉為材料，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對11個棉花抗枯萎病相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量分析，為海島棉抗枯萎病育種及抗病機(jī)理提供候選基因資源?！痉椒ā窟x擇海島棉抗枯萎病材料06-146、易感材料新海14號，及以其為父母本雜交的RIL系高代材料10893(超抗)、10895(高抗)、10897(感病)、10796(易感)為實驗材料，進(jìn)行接菌處理。分別取接菌0、4、10、18、28和40 h后的幼苗下胚軸，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)已知陸地棉抗枯萎病相關(guān)的EST序列和海島棉抗病轉(zhuǎn)錄組測序篩選到的抗病相關(guān)基因序列設(shè)計引物，進(jìn)行實時熒光定量 PCR 反應(yīng)。根據(jù)各基因在不同材料中的表達(dá)值，分析各基因與海島棉抗枯萎病間的關(guān)系?！窘Y(jié)果】CFW3、CFW10、comp62810、comp71372四個基因在海島棉抗枯萎病過程中可能起著比較重要的作用，尤其是利用抗病材料和感病材料轉(zhuǎn)錄組測序后得到的與抗病性有關(guān)的comp62810、comp71372基因。【結(jié)論】不同棉花品種對病菌侵染的靈敏程度，不同的品種的靈敏度不同，用以判斷基因的作用。

海島棉；枯萎?。豢剐曰?；實時熒光定量PCR

0 引 言

【研究意義】海島棉(GossypiumbarbadenseL.)纖維是世界上最優(yōu)良的棉纖維，是主要的紡織工業(yè)原料。新疆是我國唯一的海島棉產(chǎn)區(qū) ,優(yōu)越的自然生態(tài)條件為新疆海島棉的發(fā)展提供了得天獨厚的優(yōu)勢。棉花枯萎病(Fusariumwilt)是影響棉花經(jīng)濟(jì)性狀最主要的病害之一，在棉花生長前期，枯萎病可造成死苗，中后期則影響蕾鈴生長發(fā)育直至脫落, 導(dǎo)致棉花產(chǎn)量嚴(yán)重下降, 纖維品質(zhì)變劣。隨著新疆海島棉種植面積的逐漸擴(kuò)大，各棉區(qū)常年連作，棉花相關(guān)的病蟲害有呈逐年加劇的趨勢，特別是落葉型枯萎病迅速蔓延，生產(chǎn)中又需豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、早熟，必須在不同生態(tài)條件下具備逆抗性的海島棉品種。因此，開展海島棉抗枯萎病相關(guān)基因篩選并驗證其功效，對新疆海島棉育種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】棉花抗枯萎病方面在陸地棉中已有大量研究報道。海島棉中有關(guān)枯萎病抗性研究卻鮮見報道[5]?！颈狙芯壳腥朦c】研究使用實時熒光定量PCR技術(shù)分析相關(guān)基因在抗病性不同的材料中的表達(dá)特性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以海島棉抗枯萎病材料06-146、易感材料新海14及以其為父母本雜交的RIL系高代材料10893(超抗)、10895(高抗)、10897(感病)、10796(易感)為實驗材料，進(jìn)行不同時間的接菌處理。利用實時熒光定量PCR技術(shù)對棉花抗枯萎病相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)量分析，為篩選海島棉枯萎病抗性基因提供依據(jù)，進(jìn)而為海島棉抗枯萎病分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

根據(jù)在大田調(diào)查枯萎病情。并進(jìn)行抗病性評價后獲得抗、感病海島棉材料，分別是06-146、新海14號及以06-146、新海14號為父母本雜交篩選的RIL(Recombinant Inbred Lines，重組自交系)高代自交系10893、10895、10897、10796，其中06-146、10893、10895為抗病材料，新海14號、10796、10897為感病材料。試驗材料由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設(shè)計

將收集的種子消毒處理后，在發(fā)芽盒內(nèi)催芽，之后在事先準(zhǔn)備好的盆內(nèi)進(jìn)行水培育苗，待幼苗長至第三片真葉時，進(jìn)行接菌。接菌時溫度在25℃左右，濕度在60%以上。光照培養(yǎng)16 h/d，暗培養(yǎng)8 h/d。浸染棉花幼苗的菌液濃度為1×106個/mL，處理2 d后感病棉苗表現(xiàn)出葉片萎蔫脫落的枯萎病發(fā)病癥狀。分別取接菌0、4、10、18、28和40 h之后的幼苗下胚軸，每個至少3個重復(fù)。液氮速凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

實驗采用北京全式金RransZolTMPlant試劑盒提取RNA。由賽若公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒來進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 引物設(shè)計

通過查找國內(nèi)外有關(guān)抗性基因方面的文獻(xiàn)，在棉花EST文庫中查找與棉花抗枯萎病抗病相關(guān)序列。篩選與防御相關(guān)(Defense Relate)、脅迫相關(guān)(Stress Relate)、抗病相關(guān)(Disease-related)、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)(Cell war structure)、生長(Growth，photosynthesis)等有關(guān)的5段EST序列；以及通過轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的與抗病性有關(guān)的類黃酮合成相關(guān)(Flavonoids biosynthesis-related)、轉(zhuǎn)錄因子(Transcription factor)、棉酚合成相關(guān)(Gossypol biosynthesis-related)、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase)、糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycosyl transferase)、致病相關(guān)蛋白(Pathogenesis-related)等基因序列。設(shè)計熒光定量引物序列。表1

表1 使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study

序號Order名稱Name功能Function登陸號AccessionNO．引物Primer1CFW3脅迫相關(guān)CD485819F：GCTCGCTCTGTTTCTTCCTTTAR：ATCTTCGTTCCACTTTCCCCAT2CFW8防御相關(guān)CD486053F：GCACCAGATTGGGGGACACGACR：AGCCTTGTAAACTACCCTCACT3CFW10細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)CD486065F：TACCAGCCTTACCATCACATCR：CCACAGCACCTACAAGCAGA4CFW17生長，光合CD485661F：TGTTCGGGTTCTTCGTTCAGR：GGACAAAGTTGGTGGCATAGG5CF2抗病相關(guān)FJ966889F：GGCCCTAGCTGATCCATATTTCR：GCTCCCTAACATCTTCCTTTGT6comp55896類黃酮合成相關(guān)F：CATTGCTTCCTTGCCTGCR：CTTGGTAGTTGTGATTTGTGGAGG7comp60501轉(zhuǎn)錄因子F：GCAGCAGTGTAAGAGGATGTCCR：GTGGTCTCAGCAACAGATAGGG8comp60705棉酚合成相關(guān)F：ATGCTTCAGAACTGGGAAACTATGR：GGCTCTCTTACGACCATCAGG9comp62329谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶F：GGTGAAGGGCAACATAAAGCAGR：CCAATGACCAAGTCCCAACAC10comp62810糖基轉(zhuǎn)移酶F：CGATGCTGGGAGATGAGAAATCR：CACTTCAACTGCTTTATTCGCCTC11comp71372致病相關(guān)蛋白F：GACGCCTTCAGATAGGGACGR：CAGTCACCGTAACTAACTCCGAAC12GhUBQ7內(nèi)參F：GACCTACACCAAGCCCAAGAAGR：TGAGCCCACACTTACCACAATAGT

參數(shù)設(shè)置為：引物長度為20～25 bp，產(chǎn)物長度為100～250 bp，GC含量在40%～60%。熒光定量PCR引物由北京華大基因公司合成。

1.2.4 實時熒光 PCR 反應(yīng)

分別在接菌0、4、10、18、28和40 h取抗病材料10893、10895、06-146和感病品種10897、10796、新海14號的下胚軸，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。進(jìn)行實時熒光定量PCR分析。

熒光定量PCR反應(yīng)體系(20 μL): SYBR Green super Mix 10 μL、引物各0.5 μL、 樣本cDNA 1 μL、校正液1 μL、用ddH2O補(bǔ)至20 μL。在實驗中，先進(jìn)行95℃ 10 min，一個循環(huán)，進(jìn)行預(yù)變性；之后再95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40 個循環(huán)，是產(chǎn)物擴(kuò)增的階段。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實時熒光定量反應(yīng)結(jié)束后，通過相連的機(jī)器每個樣品的熒光信號會自動收集，對溶解曲線的圖來判斷是否為同一個基因，剔除無用數(shù)據(jù)。利用SPSS算出標(biāo)準(zhǔn)誤，根據(jù)其Ct值計算出相對表達(dá)量，計算公式如下：

目的基因相對表達(dá)量= 2-△△Ct

△△Ct=[(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組].

2 結(jié)果與分析

2.1 與棉花抗病相關(guān)EST序列熒光定量表達(dá)

研究表明，CFW3(脅迫相關(guān))在4 h時，除10897和新海14號外其他材料表達(dá)量增加，在18 h時06-146和10893擁有最大值；新海14號、10796、10895和10897在28 h擁有最大值。隨著時間延長，表達(dá)量在達(dá)到最高值后開始下降，但是抗病材料06-146和10893基因表達(dá)量在各階段均高于感病材料新海14號和10897，感病材料在這個基因上相對于抗病材料在最大值有滯后現(xiàn)象。圖1

研究表明，CFW8(防御相關(guān))在接菌4 h之后，10796和父本(06-146)瞬時表達(dá)量增加明顯，10893、10897和新海14號該基因在各時期表達(dá)量基本無變化。在18 h時06-146表達(dá)量最高，40 h時10786表達(dá)量很高，10895在28 h表達(dá)量達(dá)到最高，但是顯著低于10796和06-146的表達(dá)量。圖2

圖1 CFW3基因熒光定量
Fig.1 Fluorescence quantitative diagram of CFW3

圖2 CFW8基因熒光定量
Fig.2 Fluorescence quantitative diagram of CFW8

研究表明，CFW10(細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān))在接菌4 h之后，除新海14號外，其他材料表達(dá)量均增加，其中抗病材料06-146該基因表達(dá)量持續(xù)增高，10893、10895在10 h表達(dá)量達(dá)最高，之后表達(dá)量開始下降。感病材料10796中CFW10基因表達(dá)量也有一定程度升高，且在10 h達(dá)到最大量，但是其表達(dá)量顯著低于其他抗病材料。感病材料10897該基因在4 h表達(dá)量增加后即下降。圖3

圖3 CFW10基因熒光定量
Fig.3 Fluorescence quantitative diagram of CFW10

研究表明，CFW17(生長，光合相關(guān))在接菌后，材料總體呈下降趨勢，母本(新海14號)幾乎不表達(dá)該基因，感病材料10796表達(dá)也很少，在這個基因在該感、抗材料的差異不是很明顯，該基因在10897和06-146中表達(dá)量比較高。圖4

圖4 CFW17基因熒光定量
Fig.4 Fluorescence quantitative diagram of CFW17

研究表明，CF2(抗病相關(guān))在4 h時所有材料表達(dá)量有不同的增加，抗病材料06-146和感病材料10796在10 h是該基因表達(dá)量最高，且10796表達(dá)量高于06-146。在28 h時10895擁有最大表達(dá)量。該基因表達(dá)量在抗病材料和感病材料間沒有明顯規(guī)律性差異。圖5

圖5 CF2基因熒光定量
Fig.5 Fluorescence quantitative diagram of CF2

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序獲得與抗病相關(guān)基因的熒光定量表達(dá)

研究表明，comp55896(類黃酮合成相關(guān))在4 h時，10796與父本(06-146)的相對表達(dá)量提升顯著，在4 h時10796的相對表達(dá)量升到最高，之后表達(dá)量逐步下降。但在28 h時，10895和06-146表達(dá)量達(dá)到最大。而感病材料的相對表達(dá)量幾乎被抑制?？共〔牧吓c感病材料之間存在顯著性差異。圖6

研究表明，comp60501(轉(zhuǎn)錄因子基因)在接菌4 h時，10893與父本的瞬時表達(dá)增加明顯，28 h時，表達(dá)量最高?？共∑贩N是上調(diào)表達(dá)。其他感病品種在接菌40 h之前表達(dá)量被抑制，在40 h表達(dá)量增高。圖7

研究表明，comp60705(棉酚合成相關(guān)基因)在4 h時，除新海14號外，所有品種的表達(dá)量均有升高，抗病材料10893和父本(06-146)、感病材料10796在18 h時的表達(dá)量最大，之后隨著時間推移，表達(dá)量逐漸下降。其中以10796表達(dá)量最高。圖8

圖6 comp55896基因熒光定量
Fig.6 Fluorescence quantitative diagram of comp55896

圖7 comp60501基因熒光定量
Fig.7 Fluorescence quantitative diagram of comp60501

圖8 comp60705基因熒光定量
Fig.8 Fluorescence quantitative diagram of comp60705

研究表明，comp62329(谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶)接菌4 h時10796、10895、10897、06-146的瞬時表達(dá)量增加，28 h時達(dá)到最大?？共〔牧?0893在各時間段該基因表達(dá)量均未增加。圖9

研究表明，comp62810(糖基轉(zhuǎn)移酶)在4 h是抗病品種10893與06-146表達(dá)量增加明顯，感病品種10897、新海14號的表達(dá)量被抑制，且10893在10 h是表達(dá)量達(dá)到最高，其中母本新海14號的表達(dá)量先降低，后略有增高，在感、抗材料之間，該基因的表達(dá)量存在著很顯著的差異。圖10

圖9 comp62329基因熒光定量
Fig.9 Fluorescence quantitative diagram of comp62329

圖10 comp62810基因熒光定量
Fig.10 Fluorescence quantitative diagram of comp62810

研究表明，comp71372(致病相關(guān)蛋白)在4 h時瞬時表達(dá)量增加，18 h是相對表達(dá)量達(dá)到最高，之后隨著時間的增加，表達(dá)量遞減。該基因在抗病材料中均表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，且表達(dá)量明顯高于感病基因的，可能在海島棉抗枯萎病中起著較重要的作用。圖11

圖11 comp71372基因熒光定量
Fig.11 Fluorescence quantitative diagram of comp71372

3 討 論

植物抗病信號傳導(dǎo)兩種重要形式包括系統(tǒng)本身的抗性和誘導(dǎo)獲得的抗性，植物會在不同的刺激下進(jìn)行表達(dá)調(diào)控來防衛(wèi)病原物。根據(jù)研究表達(dá)量的變化可知：CFW3、CFW10、comp62810、comp71372等抗病相關(guān)基因，在枯萎病病菌侵染的過程中，感、抗材料之間表達(dá)有差異，其差異主要體現(xiàn)在：相對于感病材料，抗病材料的最大表達(dá)量出現(xiàn)的時間比感病材料早，表達(dá)量遠(yuǎn)高于感病材料的，所以CFW3、CFW10、comp62810、comp71372這四個基因在抗病過程中可能起著比較重要的作用，尤其是利用抗病材料和感病材料轉(zhuǎn)錄組測序后得到的與抗病性有關(guān)的comp62810、comp71372基因。

CFW17在海島棉棉花枯萎病侵染過程中隨著時間的推移，表達(dá)量會減少，推斷在受到病菌脅迫時植物光合能力和生長會受到影響。comp60501和comp62329基因在抗病材料中的表達(dá)量會比感病材料的多，最大表達(dá)量出現(xiàn)的時間，感、抗材料基本一致，推測這些基因?qū)共∮幸欢ㄓ绊?，但是對病菌的反?yīng)不如CFW3、CFW10、comp62810、comp71372基因敏感。comp60705和CF2兩基因表現(xiàn)出在感病材料10796中表達(dá)量高于抗病材料的，可能暗示海島棉抗病性與棉酚合成有關(guān)基因的表達(dá)有負(fù)相關(guān)，CF2由于是從陸地棉抗病相關(guān)EST庫中篩選到的，可能暗示陸地棉和海島棉枯萎病抗性基因的作用不一致。

CFW3、CFW10、comp62810、comp71372在海島棉中抗病材料4 h表達(dá)量增加明顯，且感病材料表達(dá)被抑制或者滯后表達(dá)，推測抗病材料對枯萎病的抗性是瞬時表達(dá)的，說明抗病材料對枯萎病菌的侵染靈敏，但在CFW8、comp55896中海島棉抗病品種表達(dá)結(jié)果比較滯后。

利用抗病材料06-146和新海14號獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在基因表達(dá)量上與抗病性的關(guān)系更為密切。comp60501轉(zhuǎn)錄因子中，抗病材料表現(xiàn)出非常高的相對表達(dá)量。comp60501轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物的抗逆性，當(dāng)植物受到侵染時，通過內(nèi)部的反應(yīng)，磷酸化級聯(lián)反應(yīng)刺激轉(zhuǎn)錄因子，讓抗逆基因進(jìn)行表達(dá)，由此提高植物抗性。所以，抗病品種的反應(yīng)很快，這有利于植物進(jìn)行阻止病菌的侵染，而感病材料的表達(dá)量不高，可能在病菌侵染時改轉(zhuǎn)錄因子并不能調(diào)控這類材料的抗病相關(guān)基因。comp62329中，谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶的作用是催化內(nèi)源性或外源性有害物質(zhì)的偶聯(lián)，增加疏水性，將有害物質(zhì)排出。接菌4 h時，10796、10895、10897、06-146的瞬時表達(dá)量增加，在28 h時達(dá)到最大，說明該類基因在海島棉抗病中可能起到一定作用。comp62810中，接菌4 h時，表達(dá)量在抗病材料中極為明顯?？共〔牧系谋磉_(dá)量基本是感病材料的4倍表達(dá)量，同時Comp71372基因在抗病或者是感病材料在10或18 h都有達(dá)到最高表達(dá)量的，但是抗病材料整體的表達(dá)量要高于感病材料，說明在海島棉中這兩個基因與海島棉康枯萎病行關(guān)系密切。

4 結(jié) 論

選用的抗病材料10893、10895和感病材料10897、10796是由06-146與新海14號雜交后得到的重組自交系，經(jīng)過兩年兩點的病田種植，抗病性鑒定篩選到的抗病、感病材料。其中親本06-146是抗病材料，新海14號是感病材料。Comp基因是利用06-146和新海14號在枯萎病侵染不同時間，取下胚軸提取RNA后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序得到的與抗病有關(guān)的基因序列。

棉花枯萎病是根部侵染的系統(tǒng)性病害，在接菌48 h內(nèi)，是病菌侵染和植株體內(nèi)受體識別病原物侵染信號并做出防衛(wèi)的關(guān)鍵時期。所以要在40 h之內(nèi)采樣。與未接菌的(0 h)材料進(jìn)行實時熒光定量Ct值的比較，觀察抗病相關(guān)基因在抗、感材料之間瞬時表達(dá)量不同，推測基因在當(dāng)時的上調(diào)或下調(diào)。對棉花下胚軸組織進(jìn)行病毒誘導(dǎo)表達(dá)特性，不同棉花品種對病菌侵染的靈敏程度，不同的品種的靈敏度不同，用以判斷基因的作用。

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Fund project:Supported by National Natural Science Foundation of China(31260361)

A Real-time PCR of Related Marker Gene in Cotton (GossypiumbarbadenseL.)

DU Rong-guang, YAO Zheng-pei, CHEN Quan-jia, ZHANG Jie, DU Li-li,SU Xiu-juan, QU Yan-ying

(College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University /Laboratory of Agricultural BiotechnologyofXinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

【Objective】 With different resistant island cottons as material, using real-time fluorescence quantitative PCR technology to analyze the expression levels of 11 genes related to wilt resistance in cotton, this project aims to provide candidate gene resources for breeding resistance varieties toFusariumwiltof sea island cotton and its mechanism.【Method】Sea Island cotton resistance toFusariumwiltdisease 06-146, the susceptible materials of Xinhai 14 and the parents of the hybrid RIL high generation materials, 10893 (super resistant), 10895 (supper resistant), 10879 (sensible) and 10796 (susceptible) were chosen as the experimental materials and at the same time, inoculation treatment was carried out. The seedlings of 0 h, 4 h, 10 h, 18 h, h, 28, 40 h, respectively, were taken to extract the mRNA and went through reverse transcription. Based on the known EST sequences ofFusariumwilt, resistance in upland cotton and the resistance related gene sequences screened from the Sea Island cotton disease resistance gene sequences, the real-time fluorescence quantitative PCR reaction was carried out. According to the expression of different genes in different materials, the relationship between different genes and the resistance toFusariumwiltof cotton were analyzed.【Result】Four genes, CFW3, CFW10, comp62810, comp71372 in cotton may play a more important role in the process of fighting againstFusariumwiltof Sea Island cotton. In particular, the comp62810 and comp71372 gene, which were obtained from the transcriptional group of the disease resistant material and the susceptible material, were related to the disease resistance.【Conclusion】Through the analysis, it is concluded that the sensitivity of different cotton varieties to the infection of the pathogen is different, which can be applied to determine the roles of the genes.

cotton (GossypiumbarbadenseL.);Fusariumwilt; real-time PCR

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.11.003

2016-05-18

國家自然科學(xué)基金項目(31260361)

杜榮光(1991- )，男，新疆博樂人，碩士研究生，研究方向為棉花抗病，(E-mail)89251760@qq.com

曲延英(1962- )，女，山東人，博士，教授，研究方向為棉花遺傳育種，(E-mail)xjyyq5322@126.com

S562

A

1001-4330(2016)11-1980-08