不同保存方法對(duì)天山櫻桃總DNA提取效果的影響

李春僑，周 龍，陸 彪，齊延巧，盛 芳

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.特克斯縣林業(yè)局，新疆特克斯 835500)

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不同保存方法對(duì)天山櫻桃總DNA提取效果的影響

李春僑1，周 龍1，陸 彪2，齊延巧1，盛 芳1

(1．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.特克斯縣林業(yè)局，新疆特克斯 835500)

【目的】尋找天山櫻桃葉片樣品較適合的保存方法，比較研究不同保存方法對(duì)天山櫻桃總DNA提取效果的影響?！痉椒ā恳蕴焐綑烟矣啄廴~片為試驗(yàn)材料，分別采用液氮保存、冷凍保存、干燥保存和微波不同時(shí)間處理后硅膠干燥保存等保存方法，比較分析各保存方法對(duì)所提取樣品總DNA質(zhì)量的影響?！窘Y(jié)果】通過(guò)-70℃冷凍保存、室溫保存、硅膠干燥保存、微波干燥2 min保存的樣品所提取總DNA的純度較高，液氮保存的樣品所提取總DNA的完整性好；干燥保存法保存的樣品所提取的總DNA擴(kuò)增效果較好?！窘Y(jié)論】考慮到野外采樣受到多方面因素的限制，適合天山櫻桃分子生物學(xué)研究的保存方法為硅膠干燥保存。

天山櫻桃；保存方法；總DNA

0 引 言

【研究意義】天山櫻桃(CerasustianschanicaPojark)又稱野櫻桃，哈薩克語(yǔ)稱其牙，屬于薔薇科(Rosaceae)櫻桃屬(Cerasus)矮生櫻亞屬植物。目前天山櫻桃在我國(guó)僅分布在新疆伊犁和塔城地區(qū)[1]。對(duì)于天山櫻桃的研究主要集中在繁殖生物學(xué)特性、植物學(xué)特征、花粉萌發(fā)特性、組織培養(yǎng)中的莖段快速繁殖、花芽形態(tài)分化等方面，但還未涉及到天山櫻桃分子生物學(xué)方面的研究。近年來(lái)對(duì)于分子生物學(xué)研究多采用分子標(biāo)記的方法，尤其從20世紀(jì)90年代以來(lái)，基于PCR的RFLP、RAPD、SSR、AFLP等新的DNA分子標(biāo)記技術(shù)層出不窮，無(wú)論采用哪種分子標(biāo)記技術(shù)，都需要獲得較高純度和濃度的DNA樣品[2]。而提取DNA的純度和濃度與材料保存方法、新鮮程度和提取方法都有密切聯(lián)系，研究天山櫻桃分子生物學(xué)，必須研究天山櫻桃葉片保存方法?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對(duì)于樣品保存方法的研究有很多，徐斌等[3]發(fā)現(xiàn)杜鵑紅山茶葉片樣品采用液氮保存，所提取樣品總DNA完整性好，純度高。黃建安等[4]認(rèn)為茶樹(shù)葉片樣品采用硅膠干燥保存，使用SDS區(qū)室法可以提取到較高質(zhì)量的總DNA。李志真等[5]發(fā)現(xiàn)光皮樺葉片樣品采用核酸分離緩沖液保存，然后再使用改良的CTAB法可獲得較高質(zhì)量的總DNA。【本研究切入點(diǎn)】天山櫻桃作為新疆特有的野生果樹(shù)種質(zhì)資源，屬于矮生櫻亞屬植物，但是目前對(duì)于其分類學(xué)上的研究還不清晰，而現(xiàn)代分類學(xué)與親緣關(guān)系的研究多采用分子標(biāo)記的方法，這就涉及到如何獲得高質(zhì)量的天山櫻桃總DNA，而天山櫻桃自然分布于新疆天山野果林，路途遙遠(yuǎn)，分布地分散，很難做到及時(shí)帶回，且天山櫻桃葉片中富含糖與多酚，增加了對(duì)其總DNA的提取難度。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】提取總DNA的質(zhì)量與保存方法密切相關(guān)，如果葉片樣品的保存方法不當(dāng)，會(huì)嚴(yán)重影響所提取總DNA的質(zhì)量。篩選出適合天山櫻桃葉片總DNA提取的最佳保存方法，獲得高質(zhì)量的總DNA。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料來(lái)源于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地引種栽培的4 a生天山櫻桃。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將采集的天山櫻桃葉片在實(shí)驗(yàn)室分為16份，處理1以新鮮葉片為材料，將新鮮葉片使用錫箔紙包好后存放在液氮中(處理2)，冷凍保存法：將葉片存放入-70℃(處理3)、葉片存放入-20℃(處理4)，干燥保存法：將葉片存放在室溫下保存(處理5)、葉片使用硫酸紙包裹后存入有硅膠的密封袋中(處理6)、葉片在烘箱50℃干燥(處理7)，微波不同時(shí)間處理：30 s、60 s、1.5 min、2 min、2.5 min、3 min、3.5 min、4.5 min、5.5 min(處理8、9、10、11、12、13、14、15、16)，所有樣品均保存26 d。

1.2.2 總DNA提取

葉片總DNA的提取方法與陳大明等[6]提取櫻桃總DNA方法相同。

1.2.3 DNA質(zhì)量檢測(cè)

紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA純度和濃度；1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA完整性；2.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)總DNA擴(kuò)增效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保存方法對(duì)總DNA純度和濃度的影響

核酸的嘌呤、嘧啶中都有共軛雙鍵，對(duì)紫外光有強(qiáng)烈的吸收作用，天然雙鏈DNA在260 nm與280 nm處的吸收比值為1.8～2.0時(shí)純度較好。不同保存方法對(duì)總DNA的純度和濃度的影響可以看出，處理3、5、6、11的樣品所提取總DNA純度較高，處理2和處理13的樣品所提取總DNA濃度最高，分別為0.8和0.95 μg/ μL；而處理1所提取總DNA濃度最低，只有0.2 μg/μL。表1

表1 不同保存方法總DNA純度和濃度變化
Table 1 Effects of preservation methods on purity and concentration of genomic DNA

編號(hào)Coad12345678OD260/OD280133218141891831633DNA濃度DNAconcentration(μg/μL)02080450350505506503編號(hào)Coad910111213141516OD260/OD2802672331831551361225DNA濃度DNAconcentration(μg/μL)0403505507095050705

注：1：新鮮葉片、2：液氮保存、3：-70℃冷凍保存、4：-20℃冷凍保存、5：室溫保存、6：硅膠干燥保存、7：烘箱干燥、8：微波30 s、9：1 min、10：1.5 min、11：2 min、12：2.5 min、13：3 min、14：3.5 min、15：4.5 min、16：5.5 min

Note：1：Fresh Leaf、2:Preservation in Liquid Nitrogen、3:Preservation at-70℃、4：Preservation at-20℃、5:Room Temperature、6: Dried with Silica、7:Dried with Oven、8:Microwave Treatment within 30 s、9：1 min、10：1.5 min、11：2 min、12：2.5 min、13：3 min、14：3.5 min、15：4.5 min、16：5.5 min

2.2 不同保存方法對(duì)總DNA完整性的影響

DNA是主要的遺傳物質(zhì)，要探究物種的遺傳多樣性，如果DNA不完整，就會(huì)對(duì)物種遺傳多樣性研究造成嚴(yán)重的影響。不同保存方法對(duì)總DNA完整性的影響可以看出：處理1和處理2的樣品所提取總DNA條帶整齊，無(wú)降解現(xiàn)象，且點(diǎn)樣孔無(wú)殘留；而處理8、9、10、11、12、13、14、15、16的樣品所提取總DNA檢測(cè)不出清晰條帶。圖1

注：1：新鮮葉片、2：液氮保存、3：-70℃冷凍保存、4：-20℃冷凍保存、5：室溫保存、6：硅膠干燥保存、7：烘箱干燥、8：微波30 s、9：1 min、10：1.5 min、11：2 min、12：2.5 min、13：3 min、14：3.5 min、15：4.5 min、16：5.5 min，下同

Note：1：Fresh Leaf、2:Preservation in Liquid Nitrogen、3:Preservation at -70℃、4：Preservation at -20℃、5:Room Temperature、6: Dried with Silica、7:Dried with Oven、8:Microwave Treatment within 30 s、9：1 min、10：1.5 min、11：2 min、12：2.5 min、13：3 min、14：3.5 min、15：4.5 min、16：5.5 min，the same as below

圖1 不同保存方法總DNA的完整性
Fig.1 Effects of preservation methods on completeness of genomic DNA

2.3 不同保存方法對(duì)總DNA擴(kuò)增效果的影響

DNA作為PCR擴(kuò)增的模板，由引物擴(kuò)增出特定的片段，如果DNA質(zhì)量不高，很可能會(huì)造成擴(kuò)增不完整和擴(kuò)增錯(cuò)誤，所以高質(zhì)量的DNA對(duì)PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)是不可缺少的。不同保存方法對(duì)總DNA擴(kuò)增效果的影響可以看出：處理5、6、7樣品所提取的總DNA可以擴(kuò)增出較多的基因位點(diǎn)，主條帶清晰一致，而處理16、17、18的樣品所提取的總DNA擴(kuò)增不出主條帶，且條帶少，彌散現(xiàn)象嚴(yán)重。圖2

圖2 不同保存方法DNA的PCR效果
Fig.2 Effects of preservation methods on PCR effect of DNA

3 討 論

3.1 不同保存方法對(duì)提取總DNA純度和濃度的影響

影響DNA純度和濃度的因素有很多，主要集中在提取DNA時(shí)多糖與酚類物質(zhì)沒(méi)有去除干凈，樣品保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品保存方法不合適等方面。研究發(fā)現(xiàn)不同保存方法對(duì)所提取天山櫻桃葉片總DNA的純度和濃度影響較大，其中處理3、5、6、11(-70℃冷凍保存、室溫保存、硅膠干燥保存、微波處理2 min)的樣品所提取總DNA的純度較高，這與李莉等[7]在棗葉片，王經(jīng)源等[8]在刺桫欏葉片上的結(jié)論一致。而對(duì)于不同保存方法對(duì)DNA提取濃度的影響，研究發(fā)現(xiàn)處理6(硅膠干燥保存)所提取的DNA純度較好，且濃度也高于均值；處理1(新鮮葉片)樣品所提取總DNA的濃度最低，只有0.2 μg/μL，這與胡學(xué)林等[9]在提取新鮮核桃葉片總DNA的濃度1.5 μg/μL相比有較大差異，造成這種差異的主要原因可能是提取DNA的試劑和加樣量不同，所以今后可以嘗試適當(dāng)增加樣品量來(lái)提高天山櫻桃總DNA的濃度。

3.2 不同保存方法對(duì)提取總DNA完整性的影響

關(guān)于不同保存方法對(duì)DNA完整性的影響研究有許多，朱田田等[10]提取使用液氮保存的中麻黃葉片總DNA，靖相密等[11]提取新鮮臘梅葉片總DNA，均可以獲得較為完整的總DNA，這與研究中處理1、處理2和處理6(液氮保存的葉片、新鮮葉片，硅膠干燥保存)中獲得完整的總DNA結(jié)果一致。同時(shí)研究中還發(fā)現(xiàn)，采用微波處理的所有天山櫻桃樣品所提取的總DNA無(wú)條帶，推測(cè)可能是微波處理時(shí)損壞了天山櫻桃葉片總DNA，造成DNA降解，因此認(rèn)為天山櫻桃葉片不適合使用微波干燥的保存方式。

3.3 不同保存方法對(duì)總DNA擴(kuò)增效果的影響

PCR擴(kuò)增的效果直接關(guān)系到分子標(biāo)記的成功與否，也是進(jìn)行基因連鎖標(biāo)記、遺傳圖譜的構(gòu)建等研究的關(guān)鍵[12]。研究發(fā)現(xiàn)處理5、6、7(室溫保存，硅膠干燥保存，烘箱干燥)的樣品所提取的總DNA通過(guò)PCR擴(kuò)增效果好，條帶清晰且基因位點(diǎn)較多，這與劉春英等[13]在楊樹(shù)葉片上，張海燕等[14]在胡楊葉片采取硅膠保存方法獲得了較好的PCR擴(kuò)增效果結(jié)論一致，但研究中硅膠干燥保存方法與劉春英和張海燕使用的硅膠保存方法不同，研究先使用硫酸紙包裹住樣品后再裝入有硅膠的密封袋中，干燥效果更好。

4 結(jié) 論

研究針對(duì)天山櫻桃葉片采用液氮保存，冷凍保存，干燥保存和微波處理四種不同的保存方法，通過(guò)檢測(cè)總DNA的質(zhì)量研究發(fā)現(xiàn)不同的保存方法對(duì)天山櫻桃葉片總DNA的質(zhì)量影響不同。當(dāng)采取-70℃冷凍保存、室溫保存、硅膠干燥保存和微波處理2 min時(shí)葉片總DNA純度較好；液氮保存和微波處理2 min有利于總DNA濃度的提高；使用液氮保存葉片樣品時(shí)，總DNA的完整性最好；當(dāng)采用硅膠干燥、室溫干燥和烘箱干燥的保存方法保存葉片樣品時(shí)，所提取的DNA可以獲得條帶完整、清晰可見(jiàn)的PCR擴(kuò)增圖譜。比較三種葉片總DNA提取質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合天山櫻桃的生境復(fù)雜性，認(rèn)為硅膠干燥是天山櫻桃葉片較為適合的保存方法。

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Fund project:Supported by NSFC (31260466) and key discipline fund of pomology of Xinjiang Uygur Autonomous Region.

Effects of Different Preservation Methods on Genomic DNA Extraction ofCerasustianschanica

LI Chun-qiao1, ZHOU Long1, LU Biao2, QI Yan-qiao1, SHENG Fang1

(1.College of Forestry and Horticulture, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2. Forestry Bureau of Tekesi County, Tekesi Xinjiang 835500, China)

【Objective】 In order to find a sui
Table method for preserving leaf samples ofCerasustianschanica, the influence of genomic DNA extraction effect of different preservation methods was compared. 【Method】Using young leaves ofCerasustianschanicaas test material, the influence of genomic DNA extraction quality was compared through different preserving methods, such as liquid nitrogen，cryopreservation，drying，microwave treatment and etc.【Result】 The result showed that the high pure genomic DNA could be extracted by-70℃ cryopreservation, room temperature preservation, silica gel dry preservation, microwave treatment within 2 min preservation method. The integrity of genomic DNA could be extracted from the leaf samples stored with liquid nitrogen preservation method. The better amplification effect could be achieved with drying preservation method.【Conclusion】 Many factors of restriction on wild sample were taken into consideration, and we think the silica preservation method is the sui
Table way to do molecular biology research onCerasustianschanica.

Cerasustianschanica；preservation methods；genomic DNA

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.05.009

2015-12-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260466)；新疆維吾爾自治區(qū)果樹(shù)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目

李春橋(1986-)，男，河南人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)，(E-mail)lichunqiao3940@126.com

周龍(1976-)，男，新疆人，副教授，博士，研究方向?yàn)楣麡?shù)種質(zhì)資源與栽培生理，(E-mail)zhoulong2004@126.com

S662.5

A

1001-4330(2016)05-0845-05