GDF11對(duì)ApoE-/-糖尿病小鼠內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的作用

梅穩(wěn) 向光大 盧俊顏 李歡 向林 董靖

基礎(chǔ)研究

·論著·

GDF11對(duì)ApoE-/-糖尿病小鼠內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的作用

梅穩(wěn) 向光大 盧俊顏 李歡 向林 董靖

目的研究生長(zhǎng)分化因子11(GDF11)對(duì)載脂蛋白 E 基因敲除(ApoE-/-)糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能的影響，探討其可能的機(jī)制。方法40只4周齡健康雄性ApoE-/-小鼠按隨機(jī)數(shù)字法選擇10只作為正常對(duì)照組(NC組)，以正常飼料喂養(yǎng)，其余30只以高脂飼料喂養(yǎng)4周后,連續(xù)5 d腹腔注射鏈脲佐菌素(50 mg/kg)制備2型糖尿病模型。將造模成功小鼠共20只按隨機(jī)數(shù)字法分為GDF11組(0.1 mg·kg-1·d-1腹腔注射，n=10)和糖尿病對(duì)照組(T2DM組，等量磷酸鹽緩沖液腹腔注射，n=10)。干預(yù)4周后，檢測(cè)各組空腹血糖、空腹胰島素、HbA1c、GDF11濃度，并計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素敏感性指數(shù)(HOMA-ISI)；測(cè)定各組小鼠離體胸主動(dòng)脈條的張力反應(yīng)及主動(dòng)脈一氧化氮含量，Western印跡檢測(cè)主動(dòng)脈內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷酸化eNOS(P-eNOS)、Smad2/3、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)水平。結(jié)果與NC組相比，T2DM組空腹血糖、空腹胰島素、HbA1c水平升高，GDF11濃度及HOMA-ISI降低，乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低；與T2DM組相比，GDF11組上述指標(biāo)均有改善(F=70.923～675.430，P均<0.01)。而硝普鈉誘導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴性舒張反應(yīng)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與NC組相比，T2DM組血管中一氧化氮含量、P-eNOS水平、磷酸化Smad2/3水平下降，GDF11組上述指標(biāo)均有顯著升高(F=40.120～148.060，P均<0.01)。結(jié)論GDF11通過(guò)促進(jìn)一氧化氮生成，激活Smad2/3信號(hào)通路，改善ApoE-/-糖尿病小鼠內(nèi)皮依賴性血管舒張功能。

生長(zhǎng)分化因子11；2型糖尿?。粌?nèi)皮依賴性血管舒張；一氧化氮

2型糖尿病(T2DM)與動(dòng)脈粥樣硬化(AS)關(guān)系密切，表現(xiàn)在患者出現(xiàn)AS的時(shí)間早、程度重、預(yù)后差。糖尿病能引起內(nèi)皮功能紊亂，而內(nèi)皮依賴性舒張功能紊亂是發(fā)生AS的一個(gè)早期標(biāo)志，也是糖尿病多種血管并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)[1]。生長(zhǎng)分化因子11(GDF11)，又名骨形態(tài)發(fā)生蛋白11，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族成員之一。GDF11是一種在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中起重要作用的蛋白，對(duì)多種器官發(fā)育起調(diào)控作用[2-4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，GDF11可以恢復(fù)衰老小鼠的神經(jīng)干細(xì)胞再生和分化潛能，增加老年小鼠大腦血管腔體積和血流量，這種作用是通過(guò)直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的[5]。本研究使用高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導(dǎo)T2DM小鼠模型，并用GDF11進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能、一氧化氮濃度的影響，探討GDF11的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 高脂飼料購(gòu)于北京華阜康公司。重組人GDF11(Pepro Tech公司)、STZ及去甲腎上腺素(Sigma公司)、血糖儀及試紙(強(qiáng)生公司)、胰島素放射免疫檢測(cè)試劑盒、HbA1c、GDF11 ELISA檢測(cè)試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司)、一氧化氮檢測(cè)試劑盒(南京凱基)、氯化乙酰膽堿(上海阿拉丁公司)、一抗[單克隆兔抗人內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷酸化eNOS(P-eNOS)、Smad2/3、磷酸化Smad2/3(P-Smad2/3)抗體]、二抗[單克隆山羊抗兔抗體(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)，美國(guó)CST公司)]、BL-420S生物信號(hào)采集系統(tǒng)、JH-2型張力換能器及HV-4恒溫灌流系統(tǒng)均購(gòu)買于成都泰盟公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 T2DM小鼠模型的建立 40只4周齡的SPF級(jí)雄性載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠[批號(hào)為SCXK(京)2014-0004]，按照隨機(jī)數(shù)字法選擇10只作為正常對(duì)照組(NC組)，予以普通飼料喂養(yǎng)。其余30只準(zhǔn)備造模，予以高脂飼料喂養(yǎng)。4周后準(zhǔn)備造模小鼠禁食12 h，連續(xù)5 d腹腔注射STZ(50 mg/kg)進(jìn)行T2DM造模，NC組僅腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射1周后測(cè)腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)，以空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L為T2DM小鼠成模標(biāo)準(zhǔn)，共造模成功20只。

1.2.2 動(dòng)物分組及干預(yù) 將造模成功的20只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為糖尿病對(duì)照組(T2DM組，n=10)和GDF11組(n=10)，GDF11組根據(jù)小鼠體重每天給予0.1 mg·kg-1·d-1的GDF11，連續(xù)4周腹腔注射[5]。NC組和T2DM組每天予以等量的磷酸鹽緩沖液腹腔注射。

1.2.3 各組小鼠體重、空腹血糖、空腹胰島素、HbA1c和GDF11濃度的測(cè)定 記錄各組小鼠第4，10，14周時(shí)的體重。14周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，尾部取血測(cè)血糖，腹腔注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉小鼠，皮膚消毒后開腹，下腔靜脈采血，離心后取血清，ELISA檢測(cè)胰島素、HbA1c和GDF11濃度。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素敏感性指數(shù)(HOMA-ISI)=1/(空腹血糖×空腹胰島素)。

1.2.4 離體胸主動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能測(cè)定 每組取其中5只采過(guò)血的小鼠，迅速開胸，剪除肺臟組織，在體式顯微鏡下移除主動(dòng)脈血管鞘及周圍結(jié)締組織，每只小鼠取出4段胸主動(dòng)脈環(huán)，每段長(zhǎng)約4 mm，將血管環(huán)懸于掛鉤，置于37℃持續(xù)通95%O2+5%CO2混合氣體的Krebs液中。在含Krebs液的恒溫灌流槽中，下方以鋼鉤固定于槽底，上方通過(guò)JH-2張力換能器連接BL-420S生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄張力變化。調(diào)整基礎(chǔ)靜息張力0.5 g，平衡1 h。血管環(huán)張力平衡后，向浴槽中加入終濃度為10-6mol/L的苯腎上腺素收縮主動(dòng)脈環(huán)，待其收縮張力達(dá)到平頂后，依次加入終濃度分別為1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6，1×10-5，1×10-4mol/L的乙酰膽堿誘導(dǎo)血管舒張，同步記錄每一濃度下主動(dòng)脈環(huán)張力的變化，取4個(gè)環(huán)的平均張力，各濃度的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)為[(最大張力-各濃度點(diǎn)張力)/(最大張力-基礎(chǔ)值)]×100%。沖洗血管重新平衡至基礎(chǔ)張力，換用濃度為10-9～10-4mol/L的硝普鈉測(cè)定血管內(nèi)皮非依賴性舒張功能。

1.2.5 主動(dòng)脈一氧化氮含量、eNOS、P-eNOS、Smad2/3、P-Smad2/3表達(dá)水平檢測(cè) 每組剩余5只采過(guò)血的小鼠，取其主動(dòng)脈的一半，加入1∶10冷生理鹽水，勻漿后離心，取上清液，按一氧化氮檢測(cè)試劑盒步驟測(cè)定。另外一半主動(dòng)脈于液氮中凍存?zhèn)錅y(cè)Western印跡。測(cè)定時(shí)，主動(dòng)脈勻漿，測(cè)蛋白濃度后，各樣本取50 μg蛋白上樣于12%的PAGE膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜于 0.2 μm的硝酸纖維素膜，室溫?fù)u床封閉2 h，然后用相應(yīng)特異性一抗[抗eNOS、P-eNOS(Ser1177)、Smad2/3、P-Smad2/3抗體]和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗處理，最后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影。

2 結(jié)果

2.1 各組體重、空腹血糖、空腹胰島素和HbA1c的

比較 10周時(shí)，T2DM組體重低于NC組(F=4.635，P<0.05)；14周時(shí)T2DM組和GDF11組體重低于NC組，但各組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與NC組相比，GDF11組、T2DM組空腹血糖、空腹胰島素、HbA1c均顯著升高，HOMA-ISI顯著下降(P均<0.01)。與T2DM組相比，GDF11組空腹血糖、空腹胰島素、HbA1c均降低，HOMA-ISI上升(P均<0.01)，見圖1，表1。

注：NC組：對(duì)照組；T2DM組：糖尿病對(duì)照組；GDF11組：GDF11干預(yù)組；GDF11：生長(zhǎng)分化因子11；與NC組相比，aP<0.01圖1 3組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重的比較

2.2 各組GDF11濃度的比較 T2DM組血清GDF11濃度低于NC組，GDF11組血清GDF11濃度高于T2DM組，但仍低于NC組[NC組：(220.71±6.83) ng/L；T2DM組：(147.46±4.92) ng/L；GDF11組：(206.47±7.03) ng/L，F(xiàn)=675.430，P<0.01]。

2.3 GDF11對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響 與NC組相比，T2DM組小鼠胸主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)顯著下降[(92.32±2.17)%vs. 60.03±3.07)%，乙酰膽堿：10-4mmol/L，F(xiàn)=590.380，P<0.01]，而對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴性舒張功能，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

表1 3組小鼠14周時(shí)空腹血糖、空腹胰島素、HbA1c和HOMA-ISI的比較

注：NC組：對(duì)照組；T2DM組：糖尿病對(duì)照組；GDF11組：GDF11干預(yù)組；GDF11：生長(zhǎng)分化因子11；與NC組相比，aP<0.01，與T2DM組相比，bP<0.01；FPG:空腹血糖；FINS：空腹胰島素；HOMA-ISI：穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估-胰島素敏感性指數(shù)

與T2DM組相比，GDF11組上述指標(biāo)得到改善[(80.85±3.26)%vs.(60.03±3.07)%，乙酰膽堿:10-4mmol/L，F(xiàn)=179.240，P<0.01]，對(duì)硝普鈉誘導(dǎo)的舒張反應(yīng)差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(93.31±4.13)%vs.(89.23±3.83)%vs.(90.59±3.27)%，硝普鈉：10-4mmol/L，F(xiàn)=1.365，P>0.05]，見圖2。

2.4 各組小鼠主動(dòng)脈一氧化氮含量和Western印跡結(jié)果 與NC組相比，T2DM組、GDF11組離體主動(dòng)脈一氧化氮含量顯著下降[NC組：(118.31±7.21) μmol/mg；T2DM組：(68.31±5.17) μmol/mg；GDF11組：(95.07±4.02) μmol/mg，P<0.01]；與T2DM組相比，GDF11組一氧化氮含量顯著升高(F=148.060，P<0.01)。Western印跡結(jié)果顯示，與NC組相比，T2DM組P-eNOS/eNOS水平顯著降低(P<0.01)，而GDF11組P-eNOS/eNOS水平顯著高于T2DM組，但低于NC組(F=40.123，P<0.01)，見圖3。與NC組和T2DM組相比，GDF11組P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3水平顯著升高(P<0.01)，而T2DM組P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3水平又顯著低于NC組(F=48.472，50.957，P均<0.01)，見圖4。

注：NC組：對(duì)照組；T2DM組：糖尿病對(duì)照組；GDF11組：GDF11干預(yù)組；GDF11：生長(zhǎng)分化因子11；Ach：乙酰膽堿；SNP：硝普鈉；與NC組相比，aP<0.05；與T2DM組相比，bP<0.05圖2 3組小鼠主動(dòng)脈對(duì)不同濃度Ach和SNP介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)

注：NC組：對(duì)照組；T2DM組：糖尿病對(duì)照組；GDF11組：GDF11干預(yù)組；GDF11：生長(zhǎng)分化因子11；eNOS：內(nèi)皮型一氧化氮合酶；P-eNOS：磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶；與T2DM組、GDF11組相比，aP<0.01；與T2DM組相比，bP<0.01圖3 GDF11對(duì)主動(dòng)脈eNOS蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究提示，通過(guò)高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ進(jìn)行T2DM造模，可以觀察到T2DM組空腹血糖、空腹胰島素和HbA1c水平較NC組明顯上升，HOMA-ISI明顯下降，提示胰島素抵抗明顯。胰島素抵抗是糖尿病患者發(fā)生AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。胰島素抵抗可引起“糖毒性”、“脂毒性”及血管內(nèi)皮功能障礙，加速AS進(jìn)展[6]。研究觀察到GDF11干預(yù)ApoE-/-糖尿病小鼠后，不僅空腹血糖、胰島素和HbA1c較T2DM組有不同程度的下降，HOMA-ISI也有所改善，顯示GDF11可以改善T2DM小鼠糖代謝水平，減輕胰島素抵抗。因此，減輕胰島素抵抗可能是GDF11改善血管內(nèi)皮功能障礙的機(jī)制之一。

血管內(nèi)皮功能障礙是包括AS在內(nèi)的多種心血管疾病的早期病理生理改變[7]。通過(guò)測(cè)定以內(nèi)皮依賴性舒張功能為代表的內(nèi)皮功能，可早期預(yù)測(cè)疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后。同時(shí)它也可以用來(lái)評(píng)估藥物是否具有心血管保護(hù)作用。本研究中，各組間非內(nèi)皮依賴性舒張功能無(wú)明顯區(qū)別，說(shuō)明血管對(duì)乙酰膽堿引起舒張反應(yīng)的差異是由內(nèi)皮功能不同引起的。T2DM組內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，GDF11組內(nèi)皮依賴性舒張功能得到改善，說(shuō)明GDF11保護(hù)了血管內(nèi)皮，即具有潛在的心血管保護(hù)作用。

注：NC組：對(duì)照組；T2DM組：糖尿病對(duì)照組；GDF11組：GDF11干預(yù)組；GDF11：生長(zhǎng)分化因子11；與NC組相比，aP<0.01；與NC組和T2DM組相比，bP<0.01圖4 GDF11對(duì)主動(dòng)脈Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

在體內(nèi)，調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性舒張功能的重要介質(zhì)是一氧化氮，它是以左旋精氨酸為底物，由eNOS催化合成的[8]。eNOS主要在動(dòng)、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，多種化學(xué)物質(zhì)和病理生理刺激如乙酰膽堿、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血糖、血脂等，參與調(diào)節(jié)eNOS的活性，從而影響一氧化氮的產(chǎn)生。一氧化氮對(duì)血管的正常功能起重要作用，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的舒張、增殖、衰老和凋亡，還具有防止AS的作用[9-10]。本研究中，T2DM組的主動(dòng)脈P-eNOS/eNOS下降，一氧化氮含量降低是導(dǎo)致其內(nèi)皮功能障礙的主要原因。體內(nèi)給予重組GDF11蛋白后，上調(diào)了eNOS的活性、增加了一氧化氮的產(chǎn)生，進(jìn)一步證實(shí)了GDF11對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥的保護(hù)作用。

GDF11實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)功能的基礎(chǔ)是先與胞膜上活動(dòng)素ⅡA和ⅡB型受體結(jié)合，再磷酸化Ⅰ型受體ALK5，形成配體受體復(fù)合物作用于胞漿內(nèi)的Smad2/3蛋白，活化的Smad2/3蛋白與通用型Smad4結(jié)合形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)[11-12]。最近的研究指出，衰老小鼠血清GDF11水平下降，它能增加小鼠大腦血管體積和分支數(shù)，體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GDF11能夠促進(jìn)大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且這種作用是通過(guò)磷酸化Smad2/3通路實(shí)現(xiàn)的[5,13]。此外，一個(gè)8.9年的隨訪研究發(fā)現(xiàn)，在穩(wěn)定性冠心病患者中，血清GDF11水平低的患者發(fā)生心血管事件(如心肌梗死、卒中、心力衰竭入院、死亡)的風(fēng)險(xiǎn)高，說(shuō)明GDF11對(duì)冠心病患者具有一定的保護(hù)作用[14-15]。本研究采用高脂飲食聯(lián)合STZ制備T2DM模型，發(fā)現(xiàn)造模后，血清GDF11水平下降。T2DM小鼠外源性補(bǔ)充GDF11后，主動(dòng)脈磷酸化Smad2、磷酸化Smad3水平升高，說(shuō)明激活了血管內(nèi)皮的Smad2/3通路，Smad2/3蛋白與Smad4蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，調(diào)節(jié)多種基因包括eNOS基因的表達(dá)，從而保護(hù)了血管內(nèi)皮。

綜上所述，本研究證實(shí)GDF11可改善ApoE-/-糖尿病小鼠的內(nèi)皮依賴性舒張功能，其機(jī)制是減輕胰島素抵抗、上調(diào)eNOS活性、增加一氧化氮濃度和激活Smad通路。但GDF11蛋白對(duì)多種心血管疾病的具體作用和相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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EffectsofGDF11onendothelium-dependentvasodiationfunctionofaortainApoE-/-diabeticmice

MeiWen*,XiangGuangda,LuJunyan,LiHuan,XiangLin,DongJing.

*WuhanClinicalInstituteAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

Correspondingauthor:XiangGuangda,Email:Guangda64@hotmail.com

ObjectiveTo explore the effects of growth differentiation factor 11 (GDF11) on endothelium-dependent vasodilation function of aorta in apolipoprotein E-Null (ApoE-/-) diabetic mice and to investigate the mechanisms.MethodsTen of the 40 healthy male ApoE-/-mice at 4-week age were selected as normal control group according to random number method and

basic diet, whereas the other 30 mice were fed with high-fat diet for 4 weeks and then treated with streptozotocin intraperitoneal injection (50 mg/kg) for 5 days to induce type 2 diabetes mellitus (T2DM). Diabetes was successfully induced in twenty mice which were then randomly divided into GDF11 group (0.1 mg·kg-1·d-1intraperitoneal injection,n=10) and T2DM control group (T2DM group, equivalent phosphate buffered saline,n=10) according to random number method. After 4 weeks of intervention, fasting plasma glucose, fasting plasma insulin, HbA1c and serum GDF11 were measured respectively. Homeostasis model assessment-insulin sensitive index (HOMA-ISI) was calculated. The relaxation response and nitric oxide levels were detected in isolated aorta of mice. Acetylcholine (Ach)-induced endothelium-dependent vasodilation and sodium nitroprusside (SNP) -induced endothelium-independent vasodilation were measured in aortas for estimating endothelial function. Endothelial nitric oxide synthase (eNOS), phosphorylated eNOS (P-eNOS) and Smad2/3, phosphorylated Smad2/3 (P-Smad2/3) were measured by Western blotting in isolated aorta of mice.ResultsCompared with NC group, fasting plasma glucose, fasting plasma insulin, and HbA1c were significantly increased, meanwhile HOMA-ISI, serum GDF11 concentration and Ach-dependent relaxation response were significantly reduced in T2DM group; compared with T2DM group, all markers mentioned above were improved in GDF11 group (F=70.923-675.430, allP<0.01); whereas the SNP-independent relaxation were not different among three groups (P>0.05). Compared with NC group, nitric oxide, P-eNOS, P-Smad2/3 were significantly decreased in T2DM group, but indexes mentioned above were all increased in GDF11 group (F=40.120-148.060, allP<0.01).ConclusionGDF11 improves endothelium-dependent vasodilation function in ApoE-/-diabetic mice by enhancing nitric oxide synthesis and Smad2/3 signaling pathways.

Growth differentiation factor 11;Type 2 diabetes mellitus; Endothelium-dependent vasodilation; Nitric oxide

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370896)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.02.007

510515 廣州，南方醫(yī)科大學(xué)附屬武漢臨床學(xué)院(梅穩(wěn)，向光大，盧俊顏，李歡)；430070 武漢，廣州

軍區(qū)武漢總醫(yī)院內(nèi)分泌科(向光大，向林，董靖)

向光大，Email: Guangda64@hotmail.com

FundprogramNational Natural Science Foundation of China (81370896)

2016-08-22)