應用ELISA方法檢測牛結核分枝桿菌Y-干擾素

黃世品，吳志鵬，梁勇

（廣東省東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞523086）

應用ELISA方法檢測牛結核分枝桿菌Y-干擾素

黃世品，吳志鵬，梁勇

（廣東省東莞市動物疫病預防控制中心，廣東東莞523086）

為了驗證ELISA方法檢測牛結核分枝桿菌Y-干擾素的可行性，應用建立的ELISA方法檢測30份牛全血，結果為陰性和陽性對照均成立，30份全血的牛結核分枝桿菌Y-干擾素均為陰性，結果表明應用ELISA方法檢測牛結核分枝桿菌Y-干擾素診斷牛結核分枝桿菌可行，可以適用于牛結核分枝桿菌的大規(guī)模監(jiān)測。

結核分枝桿菌；牛；ELISA；Y-干擾素；血清學

結核（tuberculosis）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的一種重要的人畜共患病在世界各國均有發(fā)生，對畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康具有很大的威脅。結核病在動物檢疫中具有很重要的意義，目前我國牛結核病的檢疫方法主要是牛結核菌素皮內變態(tài)反應，該方法存在費事，受外界干擾因素多等缺點。1989年Wood等建立了一種簡單的體外檢測方法，其原理是基于血液T淋巴細胞對牛結核分枝桿菌PPD的細胞免疫反應。結核菌素PPD抗原遞呈到全血組織培養(yǎng)物的淋巴細胞后，感染牛結核分支桿菌的細胞就能產生Y-干擾素，并通過基于單克隆抗體夾心ELISA檢測到。未感染牛結核分枝桿菌的淋巴細胞不會產生Y-干擾素，因此，Y-干擾素的檢測與牛結核分枝桿菌感染相關。目前，體外Y-干擾素的檢測方法已被澳大利亞、新西蘭和歐美等國家批準為正式試驗方法，并且為OIE推薦的方法。本次研究利用建立Y-干擾素ELISA檢測方法，檢測活牛交易市場的牛，驗證該方法的可行性，為牛結核的檢疫和流行病學監(jiān)測提供依據，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1牛全血30份牛全血，采自東莞市橫瀝鎮(zhèn)活牛交易市場，用頸靜脈采血，加入肝素抗凝劑，顛倒幾次混勻血液，使肝素溶解。在室溫下運送到實驗室，并在30h內進行培養(yǎng)。

1.2試劑和儀器牛結核分枝桿菌Y-干擾素試劑盒：購自瑞士BOVIGAM，批號：6332900701；牛型結核菌素，購自BOVIGAM，批號：63314017001；禽型結核菌素，購自BOVIGAM，批號：6331301701。SUNRISE酶標儀購自TECAN公司。

1.3方法

1.3.1全血培養(yǎng)將抗凝血加入24孔組織培養(yǎng)板，每頭動物加3管1.5mL分裝的抗凝血，分別無菌加入100μLPBS（陰性抗原對照）、禽型PPD、牛型PPD至相應的孔，用微量振蕩器震蕩1min，放在濕盒37℃培養(yǎng)16～24h。

1.3.2血漿樣品的收集孵育后小心吸取約500mL的上層血漿放入儲存管中，待檢，盡量避免吸入紅細胞。

1.3.3ELISA方法

1.3.3.1使用前，所有的試劑組分回復到室溫（21℃+/-5℃），加入50μL稀釋液至所需的孔，加入50μL待測樣品和陰性、陽性對照至相應的孔，震蕩混勻，室溫孵育60min。

1.3.3.2倒掉板中液體室溫洗滌6次，排干，加入100μL配制的酶標結合物，室溫孵育60min。

1.3.3.3倒掉板中液體室溫洗滌6次，排干，加入100μL底物，室溫避光孵育30min。

1.3.3.4加入50μL終止液，450nm波長讀數(shù)。

1.3.3.5結果有效性。

牛Y-干擾素陰性對照小于0.13，重復孔差值不能大于0.04；牛Y-干擾素陽性對照大于0.7，重復孔OD值變化幅度不超過平均OD值得30%，結果成立。

1.3.3.6結果判定。

牛PPD的OD值減去陰性抗原的OD值大于等于0.1且牛PPD的OD值減禽PPD的OD值大于等于0.1判為陽性。牛PPD的OD值減去陰性抗原的OD值小于0.1或牛PPD 的OD值減禽PPD的OD值小于0.1判為陰性。

2　結果

結果為陽性對照平均OD值為1.02，陰性對照平均OD值為0.02，結果成立，檢測30份牛全血，牛結核分枝桿菌結果均為陰性，詳細結果見表1。

3　討論

本次試驗采用建立的Y-干擾素ELISA檢測方法，試驗結果成立，對采自活牛交易市場的30頭牛檢測結果均為陰性，結果表明該方法可行，適用于基層獸醫(yī)實驗室的檢測，活牛交易市場的牛未發(fā)現(xiàn)有結核病陽性可能與采集的樣品比較少有關，在以后試驗加大樣品的檢測量。

牛結核病的診斷方法目前主要有三類：細菌分離培養(yǎng)鑒定、免疫學方法和細菌的核酸檢測。其中細菌分離培養(yǎng)鑒定是結核桿菌的確診方法，但是分枝桿菌生長緩慢，培養(yǎng)時間長，細菌分離率低，需要在一定生物安全防護措施的實驗室才能操作，并且需要采集組織樣品，不適合活牛的檢疫。細菌的核酸檢測，靈敏度高，特異性好，需要PCR儀或熒光PCR儀，不利于基層的檢疫。在我國的結核病檢疫中主要采用牛結核菌素皮內變態(tài)反應，但該方法存在較多假陽性，需進行現(xiàn)場檢測，試驗需要3d時間，受外界的干擾因素比較多，對操作人員要求也比較高，需要一定的檢疫經驗。采用牛體外Y-干擾素來判斷牛結核的感染，敏感性和特異性均高于皮內變態(tài)反應。體外Y-干擾素檢測方法與頸部皮試變態(tài)反應相比,可以排除一部分禽結核陽性的牛,特異性高，在牛結核病診斷中，除了常規(guī)皮試變態(tài)反應,體外Y-干擾素來判斷牛結核是最有應用價值和前景的檢測方法。

表1　牛分枝桿菌檢測結果

應用Y-干擾素檢測方法進行牛結核病的檢疫，不但可以提高牛結核分枝桿菌檢測的準確性，還可以提高檢測的速度。在實際的臨床應用中，可以把皮內變態(tài)反應和體外Y-干擾素檢測方法結合起來。在對牛進行牛結核檢疫時，先采用皮內變態(tài)反應檢測，檢測結果為陽性的牛即采取隔離措施，然后采用Y-干擾素檢測方法進一步檢測，兩種檢測方法均為陽性的牛給予淘汰，養(yǎng)殖場經過多次的淘汰，最終達到牛結核病的凈化目的。

[1]劉思國，等.牛結核病研究進展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2003，10：10-14.

[2]Wood P R，et al.Development of a simple,rapid in vitro cellular assay for bovine tuberculosis based on the production of gamma interferon[J].Res Vet Sic，1990，49:46-49.

[3]Michel Denis D，et al.Enhancement of the sensitivity of the whole-blood gamma interferon assay for diagnosis of Mycobacterium bovis infections in cattle[J].Clin Vaccine Immunol，2007，14(11): 1483-1489.

[4]Wood P R，et al.Field comparison of the interferon-gamma assay and the intradermal tuberculin test forthe diagnosis of Bovine tuberculosis[J].Aust Vet J，1991，68:286-290.

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．10.022