國(guó)槐爛皮病的病原菌鑒定及其防治措施

蔡兆煒，邳學(xué)杰，郭韋韋

（1.天津泰達(dá)綠化集團(tuán)有限公司，天津 300457；2.北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083）

試驗(yàn)研究

國(guó)槐爛皮病的病原菌鑒定及其防治措施

蔡兆煒1，邳學(xué)杰1，郭韋韋2

（1.天津泰達(dá)綠化集團(tuán)有限公司，天津 300457；2.北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083）

國(guó)槐是天津?yàn)I海新區(qū)園林綠化的重要樹(shù)種。為明確引起國(guó)槐爛皮病的病菌種類，對(duì)采自濱海新區(qū)范圍內(nèi)的國(guó)槐爛皮病病枝進(jìn)行病菌培養(yǎng)和分離純化，結(jié)合病原菌的形態(tài)特征和致病性，通過(guò)rDNA-ITS序列分析和BLAST比對(duì)來(lái)鑒定病原菌種類，得到兩種不同類別的主要病原菌（GL1、GL2），GL1與Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.（登錄號(hào)HQ845047.1）的同源性達(dá)到了100%，GL2與Tubercularia vulgaris (Tode) Fr.（登錄號(hào)HM054135.1）的同源性達(dá)到99%。針對(duì)國(guó)槐爛皮病提出相應(yīng)的防治措施，為濱海新區(qū)綠化養(yǎng)護(hù)提供依據(jù)。

國(guó)槐；爛皮??；病原菌；防治措施

國(guó)槐爛皮病是腐爛病的一種，是國(guó)槐的主要枝干病害，表現(xiàn)為枯梢型和干腐型兩種。該病在中國(guó)華北、西北和其他管理水平較低的區(qū)域均有發(fā)生。在天津?yàn)I海新區(qū)多發(fā)生于幼樹(shù)片林和移栽苗木上，主要表現(xiàn)為較常見(jiàn)的干腐型。發(fā)生初期，病斑表現(xiàn)為黃褐色水漬狀，近圓形，漸次發(fā)展為菱形，病皮組織腐爛、變軟，有酒糟味，木質(zhì)部表面出現(xiàn)褐變，病斑失水后，樹(shù)木干皮下陷或開(kāi)裂；發(fā)生后期，病斑不斷擴(kuò)大，皮層纖維分離如麻狀，易剝離，直至病斑環(huán)切枝干造成上部死亡。

目前，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)國(guó)槐爛皮病病原菌種類及其歸屬進(jìn)行了一些研究，發(fā)現(xiàn)Valsa sordida Nit、Cytospora chrysosperma(Pers)Fr、Fusarium sp、Dot-hiorella sp等均可引起國(guó)槐爛皮病[1-3]。本試驗(yàn)對(duì)天津?yàn)I海新區(qū)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)和東疆港區(qū)兩個(gè)區(qū)域的國(guó)槐爛皮病發(fā)病組織進(jìn)行抽樣采集，并進(jìn)行分離培養(yǎng)與純化，根據(jù)病菌形態(tài)和致病性，應(yīng)用基于核糖體RNA基因(即rDNA)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)的序列分析(rDNA-ITS序列分析)的方法[4-5]，對(duì)該病害的致病菌種類進(jìn)行鑒定，并從實(shí)際應(yīng)用的角度提出園林綠化養(yǎng)護(hù)工作中防治國(guó)槐爛皮病的具體措施，為濱海新區(qū)的綠化養(yǎng)護(hù)生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)樣品采集地點(diǎn)為天津市濱海新區(qū)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)和東疆港區(qū)范圍內(nèi)的國(guó)槐行道樹(shù)和防護(hù)林。該區(qū)域?qū)儆谂瘻貛О霛駶?rùn)大陸季風(fēng)型氣候，冬季寒冷干燥，夏季氣溫高、濕度大，全年平均氣溫12.3 ℃，高溫極值40.9 ℃，低溫極值-18.3 ℃。年平均降水量 618 mm，降水隨季節(jié)變化顯著[6]，因地理位置臨近渤海灣，風(fēng)力較強(qiáng)。本地區(qū)原有土壤為濱海鹽堿土，大多質(zhì)地粘重，但含鹽量大，一般在0.6%以上，鹽分組成以氯化物為主，pH值多在8以上，有機(jī)質(zhì)在0.39～1.84%之間，全氮含量在0.03%～0.1%之間。地下水位小于1 m，地下水礦化度高達(dá)30 mg·L-1[7]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病原菌的分離與純化

根據(jù)國(guó)槐爛皮病的病害癥狀特征，在試驗(yàn)區(qū)內(nèi)抽樣采集發(fā)病枝條樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，在顯微鏡下觀察發(fā)病枝條表面癥狀并將其分類，采用常規(guī)組織分離法和單孢分離法分別進(jìn)行分離純化[8]，獲得純化病原菌GL1、GL2。

1.2.2病原菌的形態(tài)特征觀察

將純化的病原菌接種于無(wú)菌PDA平板培養(yǎng)基上，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)，7 d后觀察其菌落特征，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。

1.2.3分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法提取病原菌的DNA，通過(guò)真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）PCR擴(kuò)增的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì)提取的病原菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件和反應(yīng)程序參照葉振風(fēng)等[9]的研究。產(chǎn)物由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)Blast工具在線搜索同源性較高的已知序列，以此為基礎(chǔ)鑒定病原菌。

2　結(jié)果與分析

2.1病原菌的分離純化及其形態(tài)特征

通過(guò)觀察發(fā)病枝條的表面癥狀，可將致病病原菌大致分為兩類。第一類病斑表現(xiàn)為圓形至菱形，黃褐色（圖1 A、B、C），分生孢子長(zhǎng)條形，微曲，有3隔膜(圖1D)，PDA培養(yǎng)基上的菌落前期呈淡綠至黃褐色，氣生菌絲絮狀，致密，后期孢子顏色逐漸加深，菌落變?yōu)榘导t褐色（圖1E），編號(hào)為GL1。第二類病斑表現(xiàn)為圓球形至不規(guī)則形，黑褐色（圖2 A、B、C），分生孢子單生，短棒狀（圖2 D），PDA培養(yǎng)基上的菌落為白色的羽毛狀，具少量氣生菌絲（圖2E），編號(hào)為GL2。

圖1　病原菌形態(tài)特征及培養(yǎng)形態(tài)（GL1）

A～C被害植物表面癥狀　D分生孢子　E培養(yǎng)形態(tài)（7 d）

2.2病原菌rDNA-ITS分子鑒定

以GL1、GL2菌株的基因組DNA為模版，采用rDNA的ITS區(qū)段通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均獲得1條遷移率相同且分子質(zhì)量約500 bp的擴(kuò)增條帶，進(jìn)行測(cè)序后將結(jié)果與NCBI中已登錄的相似菌株進(jìn)行同源性BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GL1、GL2與已登錄的部分菌株均存在較高的同源性，其中，GL1與Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.（登錄號(hào)HQ845047.1）[10]的同源性達(dá)到了100%（圖3），GL2與10余種已登錄的病原菌的同源性均達(dá)到了98%[3,11-12]，但與Tubercularia vulgaris (Tode) Fr.（登錄號(hào)HM054135.1）的Max Score和Total Score最高（931）（圖4）。經(jīng)鑒定，引起濱海新區(qū)國(guó)槐爛皮病的病原菌GL1、GL2確定為Fusarium tricinctum(Corda)Sacc.和Tubercularia vulgaris (Tode) Fr.。

圖3　ITS序列Blast結(jié)果（GL1）

圖4　ITS序列Blast結(jié)果（GL2）

3　結(jié)論與討論

3.1國(guó)槐爛皮病的發(fā)生原因

3.1.1氣候因素導(dǎo)致

爛皮病的發(fā)生，受環(huán)境影響很大。由于大氣環(huán)境的惡化，冬季氣溫上升，造成成片林木中的細(xì)菌病毒存活基數(shù)增大，從而加大了控制難度。病害發(fā)生期若空氣濕度大，較易發(fā)生病菌滋生傳播。

3.1.2栽植過(guò)程不合理

行道綠化、防護(hù)林等主要栽植國(guó)槐的地域，其種植品種和結(jié)構(gòu)較為單一，若栽植密度大，則易出現(xiàn)通風(fēng)不良，樹(shù)木在新的環(huán)境里適生性能較差，若苗木在出圃前后發(fā)現(xiàn)有蟲(chóng)傷、機(jī)械傷以及斷根和樹(shù)皮撕裂，或在運(yùn)輸過(guò)程中受到擠壓傷和碰傷留下機(jī)械傷口，都為腐爛病菌侵染提供了有利條件。此外，幼樹(shù)栽植過(guò)早較易受到凍害、風(fēng)害等自然災(zāi)害的侵襲，從客觀上講為腐爛病菌的侵染提供了誘因，導(dǎo)致感病率高，死亡率高[2]。

3.1.3養(yǎng)護(hù)管理不到位

在苗木采購(gòu)、運(yùn)輸、檢疫等環(huán)節(jié)中缺乏嚴(yán)格的監(jiān)督和管理機(jī)制，苗木質(zhì)量得不到保證，直接影響其生長(zhǎng)和抗病能力。重栽輕管現(xiàn)象仍然存在，苗木栽植處土壤孔隙大，蓄水、保水能力差，不及時(shí)進(jìn)行涂白、施肥，微量元素缺乏，導(dǎo)致樹(shù)木營(yíng)養(yǎng)不良，樹(shù)勢(shì)衰弱，另外，苗木栽后沒(méi)有定期開(kāi)展撫育，長(zhǎng)勢(shì)差，或撫育過(guò)程中造成樹(shù)體的機(jī)械傷或剪口傷，這些都促使腐爛病菌流行蔓延。此外，濫用農(nóng)藥也會(huì)導(dǎo)致病毒細(xì)菌的抗藥性愈來(lái)愈強(qiáng)，治理起來(lái)更困難。

3.1.4監(jiān)測(cè)防治體系不健全

目前濱海新區(qū)對(duì)城市園林植物病害的監(jiān)測(cè)體系還不健全，基本由各區(qū)域園林綠化部門(mén)分別監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)方法較為粗放單一，大多仍通過(guò)人工踏查，個(gè)別區(qū)域未配備適用的監(jiān)測(cè)儀器，如放大鏡、做標(biāo)本的必備工具等。國(guó)槐栽植范圍點(diǎn)多面廣，尚無(wú)有效適用的全面監(jiān)測(cè)體系是國(guó)槐爛皮病發(fā)生的又一重要原因。

3.2防治措施探討

3.2.1適地適樹(shù)

堅(jiān)持適地適樹(shù)的原則，選擇在適合國(guó)槐生長(zhǎng)的立地條件上栽植苗木，盡量營(yíng)造混交林，若用作行道綠化和防護(hù)林，應(yīng)與其他樹(shù)種搭配栽植為宜。

3.2.2科學(xué)栽植

明確作業(yè)技術(shù)規(guī)程，嚴(yán)格控制選苗、運(yùn)苗、栽植等過(guò)程，保證運(yùn)輸過(guò)程中做好保護(hù)措施，避免機(jī)械損傷，做到隨起隨栽，澆足底水，縮短返苗期，增強(qiáng)抗性[1]。栽植前采取浸根24 h以上或蘸泥漿等方法，保證合理的栽植密度，確保通風(fēng)良好。

3.2.3及時(shí)涂白

樹(shù)干涂白是預(yù)防和治理腐爛病的有效措施，對(duì)于幼樹(shù)尤為重要。涂白劑采用生石灰：硫磺粉：水= 1：1：3的比例，為增加附著力也可適量加入食鹽。可在早春發(fā)病初期涂抹，對(duì)病菌有一定的抑制作用，并能促進(jìn)病斑愈合。在初冬時(shí)將樹(shù)上的病枝、弱枝、老化枝及時(shí)剪除并集中燒毀，然后對(duì)樹(shù)干進(jìn)行涂抹[13]。

3.2.4加強(qiáng)養(yǎng)護(hù)管理

對(duì)國(guó)槐苗木進(jìn)行松土除草、科學(xué)施肥、合理灌溉，增強(qiáng)樹(shù)木長(zhǎng)勢(shì)，提高樹(shù)木免疫能力。同時(shí)要適時(shí)開(kāi)展整枝修剪、間伐等，防止樹(shù)木抽條、干梢，促進(jìn)林木正常生長(zhǎng)。要及時(shí)剪除病枝、枯枝，將剪下的枝條及時(shí)運(yùn)走和處理，防止病菌蔓延。

3.2.4化學(xué)防治

感病較輕的植株或林木，在加強(qiáng)養(yǎng)護(hù)管理、提高樹(shù)木長(zhǎng)勢(shì)的同時(shí)，可用刀片刮除病斑，選用10倍的食用堿水或50%退菌特100倍液等藥劑進(jìn)行噴干或涂干處理。對(duì)嚴(yán)重感染的國(guó)槐，應(yīng)及時(shí)砍去病株或刮除病部，噴灑或涂抹50%多菌靈、或50%退菌特、或70%甲基托布津等藥劑。

致謝：本試驗(yàn)在北京林業(yè)大學(xué)省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，論文撰寫(xiě)過(guò)程中受到北京林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)范鑫磊博士的幫助和指導(dǎo)，特此感謝。

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試驗(yàn)研究

S792.26

A

1002-0659（2016）05-0010-03

2016-03-02

主要作者簡(jiǎn)介：蔡兆煒（1989-），男，碩士，主要從事城市園林綠化養(yǎng)護(hù)工作。E-mail：306669971@qq.com