紫外分光光度法測定川射干須根中總黃酮的含量*

羅森，袁崇均，陳帥，王笳

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都610041）

紫外分光光度法測定川射干須根中總黃酮的含量*

羅森，袁崇均，陳帥，王笳

（四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都610041）

目的建立川射干須根中總黃酮含量測定的方法。方法采用紫外分光光度法測定川射干須根中的總黃酮含量，以射干苷為對照品，測定波長為266 nm。結(jié)果射干苷在0.824 4～9.068 4 μg/mL時(shí)與吸光度呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 8）；平均回收率為100.45%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.15%；川射干須根中總黃酮的平均含量為1.03%。結(jié)論紫外分光光度法操作簡便、靈敏、準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性和較高的回收率，可作為川射干須根的總黃酮含量測定方法。

分光光度法，紫外線；黃酮；根莖；異黃酮類；川射干

川射干為鳶尾科植物鳶尾（Iris Tectorum Maxim.）的干燥根莖，具有清熱解毒、祛痰、利咽的功效，用于熱毒痰火郁結(jié)、咽喉腫痛、痰涎壅盛、咳嗽氣喘[1]，主產(chǎn)于四川、重慶、貴州、云南、廣西等[2-3]，文獻(xiàn)報(bào)道川射干植物中含有豐富的化合物種類，包括黃酮類、三萜類、酚類及醌類等[4-6]，其總黃酮提取物有很強(qiáng)的藥理作用[7-11]，《中華人民共和國藥典》規(guī)定川射干在采收時(shí)須去除須根。然而一種植物的不同部位一般具有相似的化學(xué)成分，在川射干須根中作者也發(fā)現(xiàn)其含有豐富的總黃酮成分[12-14]，并且通過對本院培育的川射干新品系（CSG1-9）的研究發(fā)現(xiàn)，栽培的川射干中須根重量占比很大，最高可達(dá)21.93%[15]。為提高川射干全株植物的資源利用率，作者以射干苷為對照品，對川射干須根的總黃酮含量進(jìn)行了測定。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1藥物川射干須根由本院中藥種植與資源所夏燕莉副研究員提供，采自川射干培育基地（四川省成都市雙流縣），經(jīng)鑒定為鳶尾科鳶尾屬植物鳶尾（Iris Tectorum Maxim.）的須根，對照品射干苷（自制，批號：20130701，含量大于99%）。

1.1.2儀器與試劑UV-2401PC型紫外分光光度計(jì)（日本島津），CPA225D型電子天平（德國賽多利斯），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。乙醇為分析純，水為純化水。

1.2方法

1.2.1溶液的配制

1.2.1.1供試品溶液的制備采挖川射干，剪下須根，洗凈、剪碎、烘干，粉碎成細(xì)粉（過40目篩），精密稱取1.0 g，置于具塞三角瓶中，加入50 mL 70%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min，取出，稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，過濾，取續(xù)濾液，搖勻，得供試品溶液，備用。

1.2.1.2對照品溶液的制備精密稱取105℃干燥至恒重的射干苷對照品10 mg于50 mL容量瓶中，加適量70%乙醇，超聲溶解，并定容至刻度，搖勻，備用。

1.2.2測定波長的選擇取對照品、供試品溶液各1.0mL，分別置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，作為測試溶液。以70%乙醇為空白，分別將上述2種測試溶液在200～400nm時(shí)進(jìn)行掃描，得到吸收曲線，供試品與對照品的吸收曲線形狀基本一致，在266 nm處有最大吸收峰。因此選擇266 nm為測定波長。

1.2.3方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別精密吸取射干苷對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 mL于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，在266 nm波長處以70%乙醇為空白，分別測定吸光度。以射干苷對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

1.2.3.2精密度試驗(yàn)取對照品溶液1.0 mL，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻。以70%乙醇為空白，按紫外分光光度法，在266 nm波長處測定吸光度，重復(fù)測定6次。測得的吸光度值無明顯變化，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.3.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液1.0mL，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻。以70%乙醇為空白，按紫外分光光度法，在266 nm波長處測定吸光度，于0、1、2、3、4、5、6 h進(jìn)行測定。計(jì)算RSD。

1.2.3.4重現(xiàn)性試驗(yàn)取6份供試品溶液及1份對照品溶液。精密吸取對照品、供試品溶液各1.0mL，分別置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻。以70%乙醇為空白，按紫外分光光度法，在266 nm波長處測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

1.2.3.5加樣回收率試驗(yàn)取已知總黃酮含量（1.08%）的川射干須根細(xì)粉約500 mg，共6份，精密稱定，精密加入適量的對照品，分別置于6個(gè)具塞三角瓶中，加入50 mL 70%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲30 min，取出，稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，過濾，取續(xù)濾液，搖勻，得6份供試品溶液。另取1.2.1.2項(xiàng)下對照品溶液。精密吸取對照品、供試品溶液各1.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻。以70%乙醇為空白，按紫外分光光度法，在266 nm波長處測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量及加樣回收率。

1.2.4含量測定取5份1.2.1.1項(xiàng)下供試品溶液，另取1.2.1.2項(xiàng)下對照品溶液，精密吸取對照品、供試品溶液各1.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻。以70%乙醇為空白，按紫外分光光度法，在266 nm波長處測定吸光度，并計(jì)算總黃酮含量。

2　結(jié)果

2.1線性范圍線性回歸方程為Y=0.109 9X-0.017，r= 0.9998（n=11），結(jié)果表明，射干苷在0.8244～9.0684μg/mL時(shí)呈良好的線性關(guān)系。

2.2精密度試驗(yàn)RSD為0.79%。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為0.97%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4重現(xiàn)性試驗(yàn)樣品中總黃酮含量為1.05%，RSD為1.42%（n=6），表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.5加樣回收率試驗(yàn)樣品平均回收率為100.45%，RSD為1.15%，見表1。

2.6含量測定5份樣品中總黃酮平均含量為1.03%，見表2。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表2　川射干須根中總黃酮含量測定結(jié)果

3　討論

3.1供試品中總黃酮的提取川射干須根中含多種異黃酮類化合物，異黃酮類化合物的提取在試驗(yàn)前期分別采用不同濃度（30%、50%、70%、100%）的乙醇及甲醇作為提取溶媒，考察川射干須根中總黃酮含量，作者對比了超聲處理30 min和熱回流提取1 h 2種處理方法。通過波長掃描和含量測定，結(jié)果顯示，在70%乙醇為溶媒，超聲30 min條件下，所測得樣品中總黃酮含量最高。在對超聲時(shí)間的選擇上，分別選擇10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲30 min樣品含量達(dá)到最高，后續(xù)時(shí)間延長無顯著差異，故選用超聲提取30 min。

3.2測定方法的確定黃酮成分的分析測定方法主要包括薄層掃描法、高效液相色譜（HPLC）法、紫外分光光度法等。薄層掃描法在測定川射干須根中總黃酮含量時(shí)影響因素較多，測定結(jié)果波動大。另外，由于川射干須根中總黃酮成分種類較多，通過HPLC法測定每種黃酮成分的含量再加和來測定總黃酮的含量也并不現(xiàn)實(shí)。川射干須根中黃酮類化合物的紫外區(qū)間的吸光度值雖不一致，但基本都在代表性成分射干苷的最大吸光波長（266nm）的附近，而其他非黃酮類成分在此波長下影響不大，這樣既能有效避開其他成分對黃酮測定的影響，又能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。在本試驗(yàn)中，作者也曾用醋酸鉀-三氯化鋁顯色法測定川射干須根中總黃酮含量，但結(jié)果不穩(wěn)定，且常常偏高。本試驗(yàn)以射干苷為對照品，采用直接70%乙醇超聲提取30 min，樣品經(jīng)過濾、稀釋處理后直接測定總黃酮類成分的含量，結(jié)果顯示該法操作快速、簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為川射干須根中總黃酮的含量測定方法。

3.3應(yīng)用前景川射干的代表性成分，如射干苷、射干苷元、二甲基射干苷元等均為異黃酮成分，藥材中總黃酮含量的高低是實(shí)現(xiàn)藥理作用的關(guān)鍵。川射干須根所含的代表性成分與藥材相似，可能存在與川射干藥材相似的藥理作用。本試驗(yàn)通過紫外分光光度法測定川射干須根中總黃酮含量，建立了川射干須根中總黃酮的含量測定方法，為川射干這一傳統(tǒng)藥用資源的綜合利用提供了參考依據(jù)。

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UV spectrophotometric determination of total flavonoid content in roots of Rhizoma Iridis Tectori*

Luo Sen，Yuan Chongjun，Chen Shuai，Wang Jia
（Sichuan Provincial Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu，Sichuan 610041，China）

Objective To establish a method for the determination of total flavonoids content in the roots of Rhizoma Iridis Tectori.Methods The total flavonoids content in the roots of Rhizoma Iridis Tectori was determined by UV spectrophotometry with belamcandin as the control sample and the detection wavelength of 266 nm.Results Belamcandin in the range of 0.824 4-9.068 4 μg/mL showed good linear relationship with the absorbance（r=0.999 8），the average recovery rate was 100.45%，RSD=1.15%；the average content of total flavonoids in the roots of Rhizoma Iridis Tectori was 1.03%.Conclusion The established UV spectrophotometrical method is simple to operate，sensitive，accurate and has good repeatability and higher recovery rate，which can be used for the determination method of total flavonoids content in the roots of Rhizoma Iridis Tectori.

Spectrophotometry，ultraviolet；Flavone；Rhizome；Isofavones；Rhizome Iridis Tectori

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.21.004

A

1009-5519（2016）21-3270-02

四川省公益性科研院所基本科研資助項(xiàng)目（A-2014N-3）。

羅森（1982-），助理研究員，主要從事中藥藥學(xué)方面的研究。

（2016-05-20）