運動預處理對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區(qū)細胞凋亡及相關蛋白P53表達的影響①

吳孝軍，葉濤，李宏玉，姜云飛，張中偉，朱路文

運動預處理對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區(qū)細胞凋亡及相關蛋白P53表達的影響①

吳孝軍1，葉濤1，李宏玉1，姜云飛1，張中偉1，朱路文2

目的探討運動預處理對腦缺血再灌注大鼠腦組織缺血半暗區(qū)細胞凋亡程度及P53蛋白表達的影響。方法36只雄性Sprague-Daw ley大鼠隨機分為假手術組、模型組、運動預處理組，每組各12只。采用改良Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型（MCAO）。TUNEL法觀察缺血半暗區(qū)細胞凋亡情況；Western blotting檢測缺血半暗區(qū)P53蛋白的表達。結果腦缺血再灌注24 h后，模型組TUNEL陽性細胞數(shù)較假手術組明顯增加（P＜0.01），運動預處理組較模型組明顯降低（P＜0.01）；模型組P53蛋白表達明顯高于假手術組（P＜0.01），運動預處理組明顯低于模型組（P＜0.01）。結論運動預處理可下調腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區(qū)P53蛋白的表達，有效抑制缺血半暗區(qū)皮層細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用。

腦缺血再灌注；運動預處理；細胞凋亡；P53；大鼠

［本文著錄格式］吳孝軍，葉濤，李宏玉，等.運動預處理對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗區(qū)細胞凋亡及相關蛋白P53表達的影響［J］.中國康復理論與實踐，2016，22（10）：1117-1120.

CITED AS：Wu XJ，Ye T，LiHY，etal.Effectof exercise preconditioning on apoptosisand expression of P53 in ischemic penumbra in ratsafter cerebral ischem ia-reperfusion［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（10）：1117-1120.

缺血性腦卒中（ischem ic stroke）是由于大腦血液供應出現(xiàn)障礙導致局部腦組織缺血、缺氧，進而引起缺血性壞死以及腦軟化的一種疾病。通常腦缺血再灌注損傷后神經細胞損傷表現(xiàn)為病理性死亡和生理性死亡兩種形式。前者是因為嚴重的腦組織損傷而導致相對直接的細胞死亡；后者則更多表現(xiàn)為遲發(fā)性的神經細胞凋亡，這一過程是由于腦組織損傷激活細胞本身的自殺性程序而產生，且常發(fā)生于腦損傷后的缺血半暗區(qū)。神經細胞凋亡在腦缺血再灌注引起的腦組織損傷中發(fā)揮著重要作用［1-3］，如果能有效抑制這一過程的發(fā)生將有效降低腦缺血再灌注損傷，因此尋找有效的干預手段成為當今的研究熱門方向。運動預處理［4］即在缺血性腦損傷發(fā)生之前給予重復多次的運動訓練，這一過程可誘導腦缺血耐受，產生腦保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

清潔級Sprague-Daw ley雄性大鼠36只，鼠齡8～10周，體質量（220±30）g，采購于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，實驗動物質量合格證號SYXK（黑）2010007。對所有大鼠稱重并進行編號，隨機分為假手術組、模型組和運動預處理組，每組各12只。

1.2主要設備與試劑

RM 2265型切片機：德國LEICA。-80℃冰箱：美國。超純水系統(tǒng)：NW IOLVF，香港。DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司。ZH-PT型動物實驗跑臺：徐州利華電子科技發(fā)展有限公司。WD-9413B凝膠成像分析系統(tǒng)：北京。HPLAS-1000圖像分析系統(tǒng)：德國。TUNEL檢測試劑盒：羅氏公司。內參抗體β-actin：萬類生物科技。P53抗體：武漢博士德生物工程有限公司。羊抗兔IgG-HRP：碧云天公司。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備與干預

模型組自由活動3周后，參照改良Longa線栓法［5］，對大鼠進行大腦中動脈阻塞（m iddle cerebralartery occlusion，MCAO），制備局灶性腦缺血大鼠實驗動物模型。造模手術所需的全部器具必須進行嚴格的無菌消毒。大鼠使用10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉。手術切口位于大鼠頸部正中偏右位置，以便更好暴露頸總動脈（arteria carotis communis，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）以及頸內動脈（internal carotid artery，ICA），而后對CCA及ECA分別進行結扎，還需在CCA主干遠端打一活結，在這一活結之后和CCA分叉處以前用動脈夾將CCA主干夾閉，用靜脈注射器針頭在CCA主干上縱向刺一小口，將浸過蠟的魚線緩慢經CCA主干插入ICA。以頸內動脈和頸外動脈分叉處作為起點，線栓插入深度為（11±0.5）mm時，如果再進線時感到手下有輕微阻力應馬上停止，此時表明線栓已成功經ICA入顱，栓線另一端留在切口之外，切口嚴格消毒后進行縫合處理。大鼠腦缺血2 h后，緩慢且輕柔地拔出栓線約10 mm進行再灌注。

運動預處理組運動預處理方案與Ding等的研究基本［6-7］一致。實驗正式開始前，對所有大鼠進行為期3 d的適應性跑臺訓練，電動跑臺坡度為0°，速度8～10 m/m in，每天持續(xù)時間為20m in，如果出現(xiàn)不積極參與訓練的大鼠，應該及時剔除，并不斷補充符合實驗要求的大鼠。正式實驗時，運動預處理組大鼠在造模前進行3周的電動跑臺訓練，每周連續(xù)訓練6 d，休息1 d。電動跑臺坡度為0°，速度12m/m in，每天持續(xù)時間30m in，造模方法同模型組。

假手術組造模過程同上，線栓插入深度10mm以內，并且不需要進行拔線處理。

1.3.2取材及標本處理

缺血再灌注24 h后，每組取6只大鼠，4%多聚甲醛PBS緩沖液（pH=7.4，4℃）進行緩慢灌注后快速斷頭取腦，將完整的大腦浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定一夜。第2天將腦組織從視交叉之后1mm繼續(xù)向后取厚度約為3mm大腦切片，對其進行石蠟包埋等常規(guī)處理后備用，主要是用于TUNEL法觀察缺血半暗區(qū)細胞凋亡情況。對各組其余的6只大鼠迅速斷頭，在冰板上取鮮腦，分離出右側大腦皮層，迅速放入-80℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4指標檢測

1.4.1TUNEL檢測缺血半暗區(qū)神經細胞凋亡情況

石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，Proteinase K工作液21～37℃處理15～30m in；制備TUNEL反應混合液；標本與TUNEL反應混合液在暗濕盒中反應，37℃；與converter-POD在暗濕盒中反應，37℃30m in；與DAB底物反應，15～25℃10m in；拍照后蘇木素復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察凋亡細胞數(shù)目（/100μm2）。

1.4.2Western blottinng檢測缺血半暗區(qū)P53蛋白表達

提取蛋白質樣品，檢測樣品蛋白質含量。制備蛋白上樣液，組織變性，SDS-PAGE凝膠電泳，凝膠轉膜。將一抗（P53抗體，1∶1000），放入一抗工作液中，4℃孵育一夜，TBST清洗3次，每次10min；加二抗（羊抗兔IgG-HRP，1∶3000），將洗凈后的一抗反應膜置于二抗工作液中60m in；洗膜除去殘留的二抗；曝光和洗片。對膠片進行掃描，然后用凝膠圖像處理系統(tǒng)進行分析，計算灰度值。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計處理。所有數(shù)據(jù)均采用（xˉ±s）表示，組間比較采用ANOVA方差分析、LSD-t兩兩檢驗。顯著性水平ɑ=0.05。

2　結果

2.1TUNEL染色

實驗視野中TUNEL陽性細胞以神經細胞為主，其細胞核著色非常明顯，大多呈現(xiàn)為棕黃色。假手術組中，視野下TUNEL檢測陽性細胞數(shù)可見少許，為正常生理表達。模型組TUNEL陽性細胞數(shù)較假手術組明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，運動預處理組TUNEL陽性細胞數(shù)明顯減少（P＜0.01）。見表1、圖1。

表1　各組缺血半暗帶神經元TUNEL陽性細胞計數(shù)（/100μm2）

2.2Western blotting

假手術組中大鼠大腦皮層P53蛋白有基礎性表達，模型組缺血再灌注24 h后缺血半暗區(qū)P53蛋白表達較假手術組明顯增高（P＜0.01）；與模型組相比，運動預處理組缺血半暗區(qū)P53蛋白表達明顯降低。見表2、圖2。

表2　各組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)P53蛋白的表達

3　討論

細胞凋亡是細胞的正常生理性活動程序［8］。細胞凋亡的發(fā)生與多基因的表達和調控密切相關。研究表明，在腦缺血再灌注損傷過程中，神經元死亡多數(shù)為細胞凋亡［9］。通常腦缺血中心區(qū)域由于損傷相對較重，因此神經細胞以壞死為主，而細胞凋亡這一過程多發(fā)生在缺血中心周圍的半暗區(qū)。缺血性腦損傷嚴重程度與細胞凋亡關系非常密切，特別是遲發(fā)性神經細胞死亡［10］。既然細胞凋亡在局灶性腦缺血損傷后所引發(fā)的遲發(fā)性神經細胞死亡過程發(fā)揮重要作用，因此如果針對缺血半暗帶區(qū)采用更多有效的干預方法，充分利用細胞凋亡過程中的可控因素，可以有效減輕細胞凋亡的程度［11］。Mahshid等在大鼠的運動預處理實驗中研究發(fā)現(xiàn)，運動預處理使缺血性損傷后腦組織海馬區(qū)殘存更多鮮活的神經細胞，缺血性腦損傷后細胞凋亡明顯減輕［12］。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)運動預處理組大鼠腦卒中后的自噬現(xiàn)象明顯受到抑制，這一過程有效減輕神經細胞凋亡［13］。綜上所述，運動預處理可以作為一種有效的干預手段，發(fā)揮其在抑制腦缺血再灌注損傷后的細胞凋亡方面的重要作用。

本實驗選用TUNEL法對大鼠的缺血半暗區(qū)神經細胞凋亡情況進行檢測，在缺血再灌注24 h后，檢測發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織缺血半暗區(qū)均存在較為明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，這與先前相關研究發(fā)現(xiàn)的腦缺血再灌注和細胞凋亡具有相關性的結論基本符合。本實驗發(fā)現(xiàn)，假手術組大鼠僅存在非常少量的細胞凋亡，一般為生理性細胞凋亡現(xiàn)象，在缺血再灌注24 h后模型組大鼠的細胞凋亡程度與假手術組相比較出現(xiàn)明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，運動預處理組細胞凋亡程度明顯減弱（P＜0.01）。這說明運動預處理可有效減輕大鼠腦缺血再灌注后的細胞凋亡現(xiàn)象，從而發(fā)揮其腦保護作用。

圖1　各組缺血半暗帶神經元TUNEL陽性細胞表達結果（TUNEL染色，400×）

圖2　各組大鼠腦組織缺血半暗區(qū)P53蛋白Western blotting的表達結果

P53蛋白是調控神經細胞凋亡的重要蛋白，在腦缺血事件發(fā)生之初給神經細胞一定的修復時間，但如果修復失敗則進入促凋亡程序［14-15］。P53主要以調控其下游相關通路靶蛋白的方式發(fā)揮促凋亡作用［16-17］。野生型P53蛋白在腦缺血事件中通常被看作是一種重要的轉錄因子，其主要作用是調節(jié)其他細胞周期中的一些重要的關聯(lián)蛋白，如增加P21蛋白、Bax蛋白的表達，同時抑制Bcl-2蛋白、Bcl-xl蛋白的表達，以此來加快神經細胞凋亡［18-20］。本實驗發(fā)現(xiàn)，P53蛋白在腦缺血再灌注發(fā)生后開始發(fā)揮其轉錄因子的作用，引起缺血半暗區(qū)內細胞凋亡明顯增加。運動預處理在腦缺血再灌注24 h后明顯抑制P53蛋白的表達，發(fā)揮其腦神經保護作用。

運動預處理具體調控腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡過程的分子機制還不是十分明確。本實驗發(fā)現(xiàn)運動預處理可有效抑制腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡現(xiàn)象，這一機制的產生可能與抑制P53蛋白的表達密切相關。今后我們將在之前的研究基礎上，引入相關蛋白抑制劑，同時檢測P53下游通路的靶蛋白的具體表達，對運動預處理產生的腦神經保護作用展開更加廣泛而透徹的分析，為運動預處理全面應用于臨床創(chuàng)造更多的理論支持，使其更好地應用于腦缺血再灌注后腦組織損傷的防治，造福更多患者。

［1］Broughton BRS，Reutens DC，Sobey CG.Apoptotic mechanisms after cerebral ischem ia［J］.Stroke，2009，40（5）：e331-e339.

［2］Niizuma K，Yoshioka H，Chen H，et al.Mitochondrial and apoptotic neuronal death signaling pathways in cerebral ischem ia［J］.Biochim BiophysActa，2010，1802（1）：92-99.

［3］Zhang F，YinW，Chen J.Apoptosis in cerebral ischemia：executional and regulatory signaling mechanisms［J］.Neurol Res，2004，26（8）：835-845.

［4］Zhang F，Wu Y，Jia J.Exercise preconditioning and brain ischem ic tolerance［J］.Neuroscience，2011，177（177）：170-176.

［5］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversiblemiddle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（20）：84-91.

［6］Ding Y，Li J，Luan X，et al.Exercise pre-conditioning reduces brain damage in ischemic rats thatmay be associated with regional angiogenesis and cellular overexpression of neurotrophin［J］.Neuroscience，2004，124（3）：583-591.

［7］Ding YH，Li J，YaoWX，etal.Exercise preconditioning upregulates cerebral integrins and enhances cerebrovascular integrity in ischemic rats［J］.Acta Neuropathol，2006，112（1）：74-84.

［8］張雅麗，高維娟，閆鳳霞，等.黃芪注射液抑制缺氧缺糖后復氧復糖大鼠海馬神經細胞凋亡的研究［J］.中國老年學雜志，2009，29（7）：793-796.

［9］Segura T，Calleja S，Jordan J.Recommendations and treatment strategies for themanagementof acute ischemic stroke［J］.ExpertOpin Pharmacother，2008，9（7）：1071-1085.

［10］吳偉，史繼新.腦缺血再灌注損傷后神經元損傷機制及治療研究進展［J］.中國微循環(huán)，2003，7（6）：391-394.

［11］富蘇，韓經丹，周杰，等.通絡化痰膠囊對腦缺血損傷大鼠神經細胞凋亡及Bcl-2，Bax的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（8）：242-246.

［12］Mahshid T，Mohammad A，MehdiA，etal.Exercise preconditioning improves behavioral functions follow ing transient cerebral ischemia induced by 4-vessel occlusion（4-VO）in rats［J］. Arch Iran Med，2013，16（12）：697-704.

［13］Zhang L，Hu X，Jing L，etal.Physicalexercise improves functional recovery throughmitigation of autophagy，attenuation of apoptosis and enhancement of neurogenesis after MCAO in rats［J］.BMCNeurosci，2013，14（1）：1-8.

［14］Leker RR，Aharonow izM，Greig NH，etal.The roleof p53-induced apoptosis in cerebral ischemia：effects of the p53 inhibitor pifithrin alpha［J］.Exp Neurol，2004，187（2）：478-486.

［15］Culmsee C，Siewe J，Junker V，et al.Reciprocal inhibition of p53 and nuclear factor-kB transcriptional activities determines cell survival or death in neurons［J］.JNeurosci，2003，23（24）：8586-8595.

［16］LiT，Liu X，Jiang L，etal.Lossof p53-mediated cell-cycle arrest，senescence and apoptosis promotes genomic instability and prematureaging［J］.Oncotarget，2016，7（11）：11838-11849.

［17］Cregan SP，Maclaurin JG，Craig CG，etal.Bax-dependentcaspase-3 activation is a key determinant in p53-induced apoptosis in neurons［J］.JNeurosci，1999，19（18）：7860-7869.

［18］Humpton TJ，Vousden KH.Regulation of Cellular Metabolism and Hypoxia by p53［J］.Cold Spring Harb PerspectMed，2016，6（7）：a026146.

［19］Temiz P，Akka?G，Ne?e N，et al.Determination of apoptosis and cell cyclemodulators（p16，p21，p27，p53，BCL-2，Bax，BCL-xL，and cyclin D1）in thyroid follicular carcinoma，follicular adenoma，and adenomatous nodules via a tissuem icroarraymethod［J］.Turk JMed Sci，2015，45（4）：865-871.

［20］Ou X，Lu Y，Liao L，etal.Nitidine chloride induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells through a pathway involving p53，p21，Bax and Bcl-2［J］.Oncol Rep，2015，33（3）：1264-1274.

Effect of Exercise Preconditioning on Apop tosis and Expression of P53 in Ischem ic Penumbra in Rats after Cerebral Ischem ia-Reperfusion

WU Xiɑo-jun1，YETɑo1，LIHong-yu1，JIANG Yun-fei1，ZHANG Zhong-wei1，ZHU Lu-wen2
1.Heilongjiang University of ChineseMedicine，Heilongjiang，Harbin 150040，China；2.The Second HospitalAffiliated to Heilongjiang University of ChineseMedicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China
Correspondence to ZHU Lu-wen.E-mail：zhuluwen1983@126.com

Objective To explore the effectof exercise preconditioning on apoptosis and expression of P53 protein in ischem ic penumbra in rats after cerebral ischem ia-reperfusion.Methods Thirty-six Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham group，model group and exercise preconditioning group，with twelve rats in each group.Themiddle cerebral artery occlusion（MCAO）modelwas established withmodified Longa'smethod.TUNELmethod was used to observe the apoptosisof neural cells in the ischemic penumbra.Western blottingwasused to detect theexpression of P53 protein in the ischem ic penumbra.Results Twenty-fourhoursafter cerebral ischemia-reperfusion，the number of TUNEL positive cellswasmore in themodelgroup than in the sham group（P＜0.01），and was less in the exercise preconditioning group than in themodelgroup（P＜0.01）.The expression of P53 protein was higher in themodel group than in the sham group （P＜0.01），and was lower in the exercise preconditioning group than in themodel group（P＜0.01）.Conclusion Exercise preconditioning coud down-regulate theexpression of P53 protein in the ischem ic penumbra，and inhibit theapoptosisof cortical cells.

cerebral ischem ia-reperfusion；exercise preconditioning；apoptosis；P53；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.10.001

R743.3

A

1006-9771（2016）10-1117-04

1.國家自然科學基金項目（No.81503666）；2.黑龍江省自然科學基金項目（No.QC2015103）；3.哈爾濱市科技創(chuàng)新人才專項基金項目（青年后備人）（No.2014RFQGJ150）；4.黑龍江中醫(yī)藥大學研究生科研創(chuàng)新項目（No.2015-33）。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱市150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001。作者簡介：吳孝軍（1990-），男，漢族，遼寧遼陽市人，碩士研究生，主要研究方向：腦卒中中醫(yī)康復的基礎研究。通訊作者：朱路文（1983-），男，漢族，山東鄒城市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：神經系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復基礎與臨床。E-mail：zhuluwen1983@126.com。

為了研究運動預處理保護作用與半暗區(qū)的關系，本實驗以神經細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達為指標，觀察運動預處理對局灶性腦缺血再灌注半暗區(qū)的影響，深入探討運動預處理作用機制，為臨床提供有意義的實驗依據(jù)。

（2016-05-16

2016-07-22）