知柏地黃湯對(duì)解脲脲原體感染模型大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)的影響*

賓東華何清湖韓 忠陳虹歷李迎秋劉朝圣

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)（湖南 長(zhǎng)沙 410208）；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

知柏地黃湯對(duì)解脲脲原體感染模型大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)的影響*

賓東華1，2何清湖1**韓 忠1陳虹歷1李迎秋1劉朝圣1

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)（湖南 長(zhǎng)沙 410208）；2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

目的 研究知柏地黃湯對(duì)解脲脲原體（UU）感染模型大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)的影響。方法 取體質(zhì)量為（220±10）g 雄性SD大鼠80只，隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、中藥組（知柏地黃湯）、西藥組（強(qiáng)力霉素）、中西藥組（知柏地黃湯+強(qiáng)力霉素），造模成功后，假手術(shù)組與模型組給予等量的生理鹽水灌胃，治療組（中藥組、西藥組和中西藥組）給予相應(yīng)的藥物灌胃，連續(xù)用藥21d。末次給藥24h后取標(biāo)本，采用常規(guī)精液檢測(cè)法檢測(cè)精液質(zhì)量，RT-PCR法檢測(cè)精子NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)。結(jié)果 假手術(shù)組、模型組、中藥組、西藥組、中西藥組大鼠精子NADH脫氫酶mRNA表達(dá)水平分別為0.44750±0.017078、0.24750±0.015000、0.34250±0.017078、0.36500±0.012910、0.39400±0.012100；ATP合成酶mRNA表達(dá)水平分別為0.36500±0.012910、0.27250±0.009574、0.35250±0.018930、0.34750±0.017078、0.39500±0.012910；直線速度分別為（12.93±1.08）μm/s、（6.24±1.13）μm/s、（12.78±0.92）μm/s、（10.43±1.32）μm/s、（13.54±1.16）μm/s；平均速度分別為（20.32±2.08）μm/s、（12.48±3.54）μm/s、（20.48±2.16）μm/s、（17.12±3.15）μm/s、（21.72±1.83）μm/s。中西藥組NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平與模型組、中藥組、西藥組比較均有上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中西藥組精子運(yùn)動(dòng)速度與模型組、中藥組、西藥組比較均上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 UU感染大鼠模型精子運(yùn)動(dòng)速度及NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平變化，提示其可能是UU感染所致不育癥的機(jī)制之一。

知柏地黃湯； 解脲支原體； 精子； NADH脫氫酶； ATP合成酶

目前不孕不育已經(jīng)成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題，日益受到政府與醫(yī)學(xué)界的重視。在各種不育因素中，男性因素約占30%～50%［1］，生殖道感染是男性不育的重要危險(xiǎn)因素，而解脲脲原體（UU）的感染率最高［2］。研究表明，男性生殖道UU感染可致生精細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡化線粒體，干擾精子的發(fā)生及成熟，從而引起精子數(shù)目減少、活力下降、畸形率增加及膜破損等微結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而導(dǎo)致不育［3］。精子中段的線粒體鞘，通過(guò)氧化磷酸化合成ATP，在精子運(yùn)動(dòng)過(guò)程中為精子尾部鞭毛供給所需能量［4］，精子線粒體能量合成障礙將降低精子活力及受精能力。線粒體氧化磷酸化的電子傳遞鏈主要由多個(gè)復(fù)合蛋白體組成，復(fù)合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等［5］。NADH脫氫酶（復(fù)合酶Ⅰ）是線粒體呼吸鏈的起始酶，在線粒體呼吸鏈中扮演著重要的角色，為氧化磷酸化-電子呼吸鏈的入口點(diǎn)，2個(gè)電子從NADH進(jìn)入電子傳遞鏈，伴有線粒體基質(zhì)中釋放的4個(gè)質(zhì)子，再通過(guò)復(fù)合酶Ⅲ、Ⅳ的協(xié)作，完成10個(gè)質(zhì)子的跨膜易位，最終為ATP合成酶（復(fù)合酶Ⅴ）合成ATP提供動(dòng)力［6，7］。

本文在以往UU感染導(dǎo)致男性不育患者的精子活力下降的臨床觀察研究基礎(chǔ)［8］之上，為了進(jìn)一步探討知柏地黃湯治療UU感染所致男性不育癥的部分機(jī)制，我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法檢測(cè)知柏地黃湯對(duì)UU感染大鼠精子質(zhì)量及NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平的影響來(lái)揭示其部分治療機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

一、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)12～14周齡雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量（220±10）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，［實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004］，常規(guī)飼養(yǎng)。

（二）主要試劑與藥物

TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）、NADHmRNA、ATPmRNA引物（生工生物工程股份有限公司）。解脲脲原體（UU）標(biāo)準(zhǔn)株由南華大學(xué)微生物學(xué)教研室提供，將UU標(biāo)準(zhǔn)菌株（凍干品）復(fù)蘇，接種，體外實(shí)驗(yàn)用效價(jià)為10×106ccu/mL的菌液。

知柏地黃湯（熟地黃24g、淮山藥12g、山萸肉12g、茯苓（不去皮）9g、澤瀉9g、牡丹皮9g、鹽知母6g、鹽黃柏6g），藥物炮制及用量基本按《醫(yī)宗金鑒》所載執(zhí)行。按以上用藥比例在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房購(gòu)買藥材，采用水煎后制備成0.94g生藥/mL煎劑備用。強(qiáng)力霉素（鹽酸多西環(huán)素片，江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H32021266），0.1g/片，臨用時(shí)用滅菌注射用水配成含強(qiáng)力霉素2mg/mL濃度的混懸液。

（三）實(shí)驗(yàn)儀器

ABI-7300型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)，ABI公司）、組織勻漿機(jī)（FLUKO，PRO200），核酸蛋白分析儀，蝸旋震蕩器（青浦瀘西儀器廠、K30），臺(tái)式微量離心機(jī)等。

二、方法

（一）模型建立

（2）造成財(cái)政資源浪費(fèi)。安排財(cái)政專項(xiàng)，是基于各部門要完成特定的任務(wù)，如果項(xiàng)目執(zhí)行進(jìn)度慢，資金一直“趴在”賬上不動(dòng)，資金的使用效益就無(wú)從談起，從另一個(gè)方面也反映了相關(guān)部門任務(wù)沒完成，要不錢怎么會(huì)“花”不出去，影響高校事業(yè)的健康發(fā)展。到年底，為了完成進(jìn)度，必然盲目突擊花錢，資金沒用在“刀刃”上，造成了財(cái)政資金的浪費(fèi)。

參照李楠等［9］造模方法。從80只SD大鼠中隨機(jī)抽取65只，建立UU感染動(dòng)物模型，余下15只注射生理鹽水。于接種后的第10天隨機(jī)取出5只造模大鼠處死，取大鼠附睪剪碎組織液運(yùn)用培養(yǎng)法檢測(cè)UU，判斷造模成功否。

（二）動(dòng)物分組與給藥

動(dòng)物造模成功后，隨機(jī)分為模型組（知柏地黃湯）組、西藥（強(qiáng)力霉素）組、中西藥（知柏地黃湯組+強(qiáng)力霉素）組，同時(shí)設(shè)假手術(shù)對(duì)照組，每組15只大鼠。各治療組給相應(yīng)藥物灌胃，假手術(shù)組、模型對(duì)照組給等量生理鹽水灌胃，每日2次。知柏地黃湯組給藥量為（8.56g生藥/kg·d-1）（按體表面積計(jì)算相當(dāng)60 kg成人用量），強(qiáng)力霉素組給藥量為（20mg/kg·d-1），中西組給予等量的知柏地黃湯與強(qiáng)力霉素。各組均連續(xù)灌胃21d。

（三）取材與指標(biāo)檢測(cè)

1. 精子懸液制備及精子活力檢測(cè)：頸椎脫臼處死老鼠后，無(wú)菌操作取一側(cè)附睪放入盛有5mL已預(yù)熱至37℃PBS液的無(wú)菌玻皿中，剪碎，搖勻，將含有精子的培養(yǎng)皿置37℃ CO2培養(yǎng)箱中，充分?jǐn)U散5min，制備精子懸液。用PBS液按1：5比例稀釋精子懸液，充分搖勻后置于37℃電子顯微鏡下觀察，用×4倍顯微攝錄相機(jī)記錄精子運(yùn)動(dòng)圖像，并用精子動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)測(cè)定［10］。

2. 精子細(xì)胞NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA檢測(cè)：取精子懸液，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行，引物序列：從NCBI中下載以下基因序列，引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件，引物序列見表1。

表1　引物序列

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

于接種后的第10天隨機(jī)取出5只造模大鼠處死，取附睪剪碎組織液運(yùn)用培養(yǎng)法檢測(cè)UU，5只大鼠均培養(yǎng)出UU，說(shuō)明造模成功。治療后處死各組大鼠，取附睪剪碎組織液培養(yǎng)UU，結(jié)果顯示：假手術(shù)組未培養(yǎng)出UU，模型組培養(yǎng)UU陽(yáng)性率93.3%（14/15），中藥組培養(yǎng)UU陽(yáng)性率33.3%（5/15），西藥組培養(yǎng)UU陽(yáng)性率26.7%（4/15），中西藥組培養(yǎng)UU陽(yáng)性率20%（3/15）。與假手術(shù)組比較，模型組UU陽(yáng)性率高，兩組間比較差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，中藥組、西藥組、中西藥組培養(yǎng)UU陽(yáng)性率均降低，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中藥組、西藥組的UU陽(yáng)性率與中西藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

二、各組大鼠精子質(zhì)量及精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的比較

從表2可看出：與模型組比較，假手術(shù)組及各治療組精子直線速度、平均速度均有上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與西藥組比較，假手術(shù)組及中藥組和中西藥組精子直線速度、平均速度均有上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2　各組大鼠精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)比較（±s，n=15n=15）

表2　各組大鼠精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)比較（±s，n=15n=15）

注：與模型組比較，*為P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.01

組別 　n 直線速度（μm/s） 平均速度（μm/s）假手術(shù)組 　15 　12.93±1.08*△　20.32±2.08*△模型組 　15　6.24±1.13　12.48±3.54中藥組 　15　12.78±0.92*△　20.48±2.16*△西藥組 　15　10.43±1.32*　17.12±3.15*中西藥組 　15　13.54±1.16*△　21.72±1.83*△

三、各組大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、mRNA ATP合成酶mRNA表達(dá)的比較

從表3、圖1可看出：與假手術(shù)組比較，模型組及各治療組精子線粒體NADH脫氫酶mRNA表達(dá)水平下降，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ATP合成酶mRNA表達(dá)水平模型組有下降，而中西藥組上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中藥組和西藥組均有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，各治療組線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平均有上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與中西藥組比較，中藥組與西藥組線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01、P＜0.05）。

表　3大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNAA　、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平情況（±s）

表　3大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNAA　、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平情況（±s）

注：與假手術(shù)組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.01，**P＜0.05；與中西藥組比較，△P＜0.01，△△P＜0.05

組別 n 　NADH mRNA　ATP mRNA假手術(shù)組 15 　0.44750±0.017078　0.36500±0.012910模型組 15　0.24750±0.015000▲　0.27250±0.009574▲中藥組 15　0.34250±0.017078▲*△　0.35250±0.018930*△西藥組 　15　0.36500±0.012910▲*△△　0.34750±0.017078*△中西藥組 15　0.39400±0.012100▲**　0.39500±0.0012910▲*

圖1　NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)

討 論

精子的運(yùn)動(dòng)，特別是快速前向運(yùn)動(dòng)能力在男性生殖中具有重要的意義，精子運(yùn)動(dòng)能力與精子線粒體的功能密切相關(guān)。線粒體作為細(xì)胞最重要的細(xì)胞器，為生命活動(dòng)提供基本能量。線粒體是精子運(yùn)動(dòng)的供能中心，線粒體的呼吸功能正常與否與精子的運(yùn)動(dòng)能力直接相關(guān)。線粒體供能主要通過(guò)位于線粒體內(nèi)膜上的5個(gè)呼吸鏈復(fù)合酶完成，即：NADH脫氫酶（復(fù)合體Ⅰ）、琥珀酸-Q氧化還原酶（復(fù)合體Ⅱ）、UQ-細(xì)胞色素C氧化還原酶（復(fù)合體Ⅲ）、細(xì)胞色素C氧化酶（復(fù)合體Ⅳ）和ATP合成酶（復(fù)合體Ⅴ）［11］。

我們課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)UU感染可以導(dǎo)致精子質(zhì)量下降［8］，本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)UU感染后大鼠精子直線速度及平均速度均有下降，而知柏地黃湯干預(yù)后精子質(zhì)量參數(shù)均有改善。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，UU感染后大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平均有下降，兩者間可能存在一定的聯(lián)系，因此，我們猜測(cè)引起UU感染所致精子質(zhì)量下降的內(nèi)在原因可能是UU感染破壞精子結(jié)構(gòu)，引起大鼠精子線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平下降，精子線粒體呼吸功能受損，ATP生成障礙，精子運(yùn)動(dòng)供能降低，從而導(dǎo)致精子的質(zhì)量發(fā)生改變，精子的直線速度及平均速度降低。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UU感染性不育（精子活力低下）其病機(jī)多以陰虛為本，濕熱為標(biāo)；其病因多為房室不潔或攝養(yǎng)失慎，染及穢濁之毒，侵入前陰，浸淫于上，阻于膀胱，擾及精室，致局部氣血運(yùn)行滯塞，濕熱蘊(yùn)結(jié)熏蒸，濕熱穢濁之邪纏綿不愈，濁毒久戀，化火傷陰，伐傷腎陰導(dǎo)致腎陰不足，腎精虧虛，無(wú)以化陰陽(yáng)而生精養(yǎng)精，或虛火灼精，使精少、活力低下而不育；本病病位在下焦，以腎陰虧虛為本，濕熱為標(biāo)，病性屬虛實(shí)夾雜之證，以虛為主，其基本病機(jī)為腎陰虧虛，兼有濕熱瘀滯。故在臨床中運(yùn)用滋陰補(bǔ)腎、清熱利濕、解毒化濁的知柏地黃丸為基本方治療取得了滿意臨床療效。

知柏地黃丸出自《醫(yī)宗金鑒》，由六味地黃丸加知母、黃柏而成。六味地黃丸之“三補(bǔ)”，即熟地黃滋補(bǔ)腎陰，山茱萸滋腎益肝，山藥滋腎補(bǔ)脾，共成三陰并補(bǔ)而以補(bǔ)腎為主。丹皮、茯苓、澤瀉為“三瀉”，合用以淡滲利濕，苦以燥濕，且澤瀉尚能瀉腎中之熱，利水而不傷陰。加上知母清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥，與苦寒之黃柏相須為用，更增強(qiáng)了滋腎陰清相火的作用。以上諸藥，滋陰補(bǔ)腎，清熱利濕，頗合 UU感染性不育腎虛為本、濕熱為標(biāo)之病機(jī)，為治療本病之中醫(yī)基本方，臨證加減每多取效［8，12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UU感染可導(dǎo)致大鼠精子直線速度、平均速度及線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平均有下降，這可能是UU感染所致男性不育患者精子活力低下的病理機(jī)制之一。知柏地黃湯干預(yù)后，大鼠精子直線速度、平均速度及線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平均有上升，其中知柏地黃丸+強(qiáng)力霉素組的上升最為明顯，且UU感染率明顯降低，與模型組比較，有顯著性差異，說(shuō)明中西結(jié)合治療可有效殺滅UU，改善UU感染后大鼠精子質(zhì)量，提高精子運(yùn)動(dòng)能力，上調(diào)線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平，增加線粒體ATP的生成，這與以往研究發(fā)現(xiàn)精子活力與精子線粒體功能呈正相關(guān)性的結(jié)論是一致的［13］。

本研究結(jié)果表明，知柏地黃湯可能通過(guò)增加線粒體NADH脫氫酶mRNA、ATP合成酶mRNA表達(dá)水平，提高精子線粒體呼吸功能，增強(qiáng)精子線粒體能量產(chǎn)生，提高精子供能，從而達(dá)到提高精子運(yùn)動(dòng)能力的目的。

1 楊華君， 惠亞， 施尚鵬， 等. 解脲脲原體和沙眼衣原體感染對(duì)男性不育影響的Meta分析. 中國(guó)男科學(xué)雜志 2015；29（5）： 36-42

2 周興， 何清湖， 周青， 等. 1599例前列腺液標(biāo)本支原體感染檢測(cè)及藥敏結(jié)果分析. 中國(guó)性科學(xué) 2014； 23（12）： 9-11

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13 Ferramosca A， Provenzano SP， Coppola L， et al. Mitochondrial respiratory efficiency is positively correlated with human sperm motility. Urology 2012；79（4）： 809-814

（2016-05-08收稿）

Effect of Zhibai Dihuang Decoction on the expressions of sperm mitochondrial NADH dehydrogenase and ATP synthase in rat model of Ureaplasma urealyticum infection*

Bin Donghua1，2， He Qinghu1**，Han Zhong1， Chen Hongli1， Li Yingqiu1， Liu Chaosheng1
1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208， China； 2. The First Affi liated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine
Corresponding author： He Qinghu， E-mail： hqh1111@tom.com； Tel： 13787105021

Objectivee To investigate the effects of Zhibai Dihuang Decoction on the expressions of sperm mitochondrial NADH dehydrogenase and ATP synthase in rat model of Ureaplasma urealyticum （Uu） infection. Metthhooddss Total of 80 male SD rats with body mass of （220+10）g were randomly divided into sham operation group，model group， Chinese medicine group （Zhibai Dihuang Decoction）， western medicine group （doxycycline）， western group （Zhibai Dihuang Decoction plus doxycycline）， After rat models were successfully established， rats in the sham operation group and the model group were given equal amount of normal saline， and rats in the treatment groupwere intragastrically given the corresponding medicine， and the drug was administered continuously for 21 days. During 24 hours after the last administration， semen samples were collcetd， and the semen quality was detected by routine semen detection. RT-PCR was used to detect the expression of NADH dehydrogenase and ATP synthase in sperm. Results The expression levels of sperm NADH dehydrogenase in the control group， model group， Chinese medicine， western medicine group， the group of Chinese and western of rat were 0.44750±0.017078， 0.24750±0.015000， 0.34250±0.017078，0.36500±0.012910， and 0.39400±0.012100 respectively； The expression levels of ATP synthetase were 0.36500±0.012910，0.27250±0.009574， 0.35250±0.018930， 0.34750±0.017078 and 0.39500±0.012910 respectively； Linear velocity were（12.93±1.08）μm/s， （6.24±1.13）μm/s， （12.78±0.92）μm/s， （10.43±1.32）μm/s， （13.54±1.16）μm/s； Average speed of（20.32±2.08）μm/s， （12.48±3.54）μm/s， （20.48±2.16）μm/s， （17.12±3.15）μm/s， （21.72±1.83）μm/s. the expression levels of NADH dehydrogenase and ATP synthase in Chinese and western group level were signifi cant increased compared with that in the model group， Chinese medicine group， western medicine group （P＜0.01）， and sperm motility， vitality， motion velocity were also remarkably increased， the differences were statistically signifi cant （P＜0.01）. Conclusionusion The change of sperm motility rate and the expression of NADH dehydrogenase and ATP synthase may be one of the mechanisms of UU infection-caused infertility.

Zhibai Dihuang Decoction； ureaplasma urealyticum； Spermatozoa； NADH dehydrogenase；ATP synthase

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.001

R 698.2

資助：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373641，81603634）；湖南省中醫(yī)藥管理局課題資助項(xiàng)目（2015101）

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