桃上蘋(píng)果褪綠葉斑病毒的發(fā)生與檢測(cè)

王海榮　劉偉　安淼　董曉民　余賢美

摘要：對(duì)山東省果樹(shù)研究所試驗(yàn)基地‘玉妃、‘超紅、‘岱妃三個(gè)桃品種的蘋(píng)果褪綠葉斑病毒病的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，采集22份樣品，利用ACLSV特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在‘玉妃桃的葉片中擴(kuò)增出與蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV）預(yù)期大小一致的目的片段，并與Gen-Bank登錄的病毒核苷酸序列具有較高的一致性，而在‘超紅和‘岱妃桃中均未檢測(cè)到該病毒。

關(guān)鍵詞：桃；蘋(píng)果褪綠葉斑病毒；病原檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.621.1⁺9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2016）04-0109-03

桃（Prunus persica L.）為薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）桃亞屬（Amygdalus）多年生中型喬木，在我國(guó)有著悠久的栽培歷史。近年來(lái)，桃樹(shù)栽培面積不斷擴(kuò)大，以及栽培中苗木引種和調(diào)運(yùn)、無(wú)性繁殖代數(shù)增多等因素，加快了桃病毒病的傳播和發(fā)生，極大地影響了桃樹(shù)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蘋(píng)果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leafspot virus，ACLSV）屬于潛隱性病毒，寄主范圍和分布較廣，能侵染多種果樹(shù)，在世界各國(guó)均有發(fā)生。桃感染該病后，葉片上出現(xiàn)深綠光點(diǎn)或波浪狀斑，該癥狀稱(chēng)為桃深綠光點(diǎn)斑駁，在溫室比大田更為明顯。某些品種感病后會(huì)引起不親和現(xiàn)象，如果用李作砧木，在6～8年后出現(xiàn)親和力不強(qiáng)現(xiàn)象，嫁接口壞死樹(shù)體衰弱。本研究中筆者對(duì)‘玉妃、‘超紅、‘岱妃三個(gè)桃新品種進(jìn)行蘋(píng)果褪綠葉斑病毒檢測(cè)，為下一步建立無(wú)毒桃繁殖體系和培育桃優(yōu)良品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試3個(gè)桃品種（‘玉妃、‘超紅、‘岱妃）于2014年9月取自山東省果樹(shù)研究所桃試驗(yàn)基地（泰安）。每棵樹(shù)采集10個(gè)枝條作為一個(gè)樣品，隨機(jī)采集有疑似病毒病和無(wú)發(fā)病癥狀的幼嫩部位枝條，裝入塑料袋，編號(hào)標(biāo)記后立即放人冰盒，帶回實(shí)驗(yàn)室取葉片作為待測(cè)物。其中，‘玉妃桃采集10棵樹(shù)，編號(hào)分別為YF1～YF10；‘超紅桃采集10棵樹(shù)，編號(hào)分別為CH1～CH10；‘岱妃桃采集2棵樹(shù)，編號(hào)分別為DF1、DF2。

1.1.2 主要試劑 TRNzol Reagemt，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自Axygen試劑公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 參考用TRIzol法提取桃葉片總RNA，得到的RNA溶液保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 用于檢測(cè)蘋(píng)果褪綠葉斑病毒的引物序列為ACLSV-F（5-TCTGCAAGAGAATTTCAGTT-3）和ACLSV-R（5-GTCTACAG-GCTATTTATTATAAG-3）。

1.2.3 RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄：在1.5mL離心管中加入RNA模板1μL，2.5mmol/LdNTPs2μL，5×M-MLVbuffer2μL，20μmol/L6-Rad0.5μL，20μmol/LOligo（dT）0.5μL，40U/μLRNaseinhibitor0.5μL，200U/μLM-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL，加ddH₂O至總體積為10μL。25℃放置10min，42℃放置1h，冰浴2min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增：PCR體系為2×TaqPCRMaster-mix7.5μL，20μmol/LR-primer和20μmol/LF-primer各0.5μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL，加ddH₂O至總體積為15μL，充分混勻后置于PCR儀中。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析 PCR產(chǎn)物的純化、連接、轉(zhuǎn)化和克隆篩選：按試劑盒操作指南，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的純化，分別將純化產(chǎn)物連接至pGEM-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸感菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選單菌落置于1mLLB培養(yǎng)基（含氨芐青霉素）中培養(yǎng)，通過(guò)菌液PCR檢測(cè)來(lái)鑒定重組質(zhì)粒。

目的片段的序列測(cè)定和分析：經(jīng)菌液PCR，篩選3個(gè)陽(yáng)性菌液送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。通過(guò)BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索目的片段的同源序列，并用DNAMAN軟件對(duì)蘋(píng)果褪綠葉斑病毒的基因片段序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

以不同品種桃葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后連接至pGEM-T，克隆測(cè)序。結(jié)果（圖1）顯示，從‘玉妃桃樣品YF2、YF7、YF10中可擴(kuò)增得到800bp的特異片段，與預(yù)期產(chǎn)物大小相同，與GenBank中已報(bào)道的ACLSV分離物的核苷酸序列（登錄號(hào)NC001409）一致性為96%，檢出率為13.64%。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)有豐富的桃品種資源，種植廣泛。病毒病的發(fā)生一直是影響我國(guó)桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要原因之一，進(jìn)行病毒檢測(cè)是建立無(wú)病毒苗木繁殖的必要條件。本研究對(duì)山東省果樹(shù)研究所桃試驗(yàn)基地（泰安）3個(gè)桃品種的蘋(píng)果褪綠葉斑病毒的發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：從3株‘玉妃桃（YF2、YF7、YF10）中檢測(cè)到該病毒，檢出率為13.64%。

蘋(píng)果褪綠葉斑病毒在桃樹(shù)上一直有著較高的發(fā)病率。阮小鳳等（1998）對(duì)陜西省桃主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況的調(diào)查和檢測(cè)結(jié)果顯示，ACLSV的發(fā)生較普遍，單獨(dú)感染率為15.8%，與各種病毒的混合感染都有出現(xiàn)；牛飛慶（2012）從我國(guó)12個(gè)省的417份桃樹(shù)樣品中檢測(cè)出ACLSV的帶毒率為20%；于云（2013）從我國(guó)12個(gè)省的505份桃樹(shù)樣品中檢測(cè)到ACLSV、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒（CGRMV）、李屬壞死環(huán)斑病毒（PNRSV）、杏假褪綠葉斑病毒（APCLSV），其中ACLSV的感染率最高達(dá)71.8%，而且山東省的病毒發(fā)生率高達(dá)58.3%?？傊?，不同地區(qū)桃樹(shù)的病毒病發(fā)生情況與繁殖用苗帶毒與否有很大關(guān)系，一旦繁殖材料帶毒，就會(huì)加快桃樹(shù)病毒病的傳播蔓延，所以使用無(wú)病毒繁殖材料和選擇抗性強(qiáng)的桃樹(shù)品種是預(yù)防桃病毒病的重要手段。本試驗(yàn)只在‘玉妃桃上檢測(cè)到ACLSV，表明‘超紅和‘岱妃有著相對(duì)強(qiáng)的抗病性。由于本試驗(yàn)檢測(cè)的樣品數(shù)量有限，還無(wú)法確定該病毒在本地區(qū)的分布情況，仍需進(jìn)一步調(diào)查研究。