高效液相色譜法測(cè)定人血漿中百草枯濃度

?

高效液相色譜法測(cè)定人血漿中百草枯濃度

目的 建立人血漿中百草枯濃度高效液相色譜檢測(cè)方法，為百草枯中毒患者預(yù)后評(píng)估、治療方案選擇提供方法學(xué)支持。方法 樣品處理采用35%高氯酸處理。流動(dòng)相為0.1mol·L-1磷酸緩沖液(含75 mmol·L-1庚烷磺酸鈉)-乙腈(88∶12，三乙胺調(diào)pH=3.0)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為28℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm。結(jié)果 所采用方法在0.2～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。平均絕對(duì)回收率為100.6%，RSD均小于3%；平均相對(duì)回收率為101.31%，RSD均小于6%。日內(nèi)和日間RSD均小于6%，凍融及凍存后百草枯樣品濃度測(cè)定結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 高效液相色譜檢測(cè)方法快速，準(zhǔn)確、血液中雜質(zhì)無(wú)干擾，適用于百草枯中毒患者血藥濃度的分析測(cè)定。

百草枯；液相色譜法；血藥濃度

百草枯(paraquat，PQ)是目前廣泛應(yīng)用的有機(jī)雜環(huán)類(lèi)除草劑，對(duì)人畜均具有高毒性[1]?？诜卸緸槠渲饕卸就緩剑墨I(xiàn)[2]報(bào)道人口服百草枯死亡率高達(dá)50%以上，目前臨床尚無(wú)有效治療方法。百草枯經(jīng)血液循環(huán)分布于肺、肝、腎、甲狀腺、肌肉中，造成多器官系統(tǒng)功能損害，是百草枯中毒死亡的主要原因[3]。血液中百草枯濃度與救治成活率密切相關(guān)，并可早期預(yù)測(cè)患者預(yù)后[4]。對(duì)于百草枯的分析檢測(cè)方法有紫外分光光度法、色譜法、毛細(xì)管電泳法等多種方法[5-7]，其提取方法也有液-液萃取法、固相萃取法等多種[8]，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于臨床實(shí)踐應(yīng)用。本文采用簡(jiǎn)單的蛋白沉淀法處理血漿樣本，建立專(zhuān)一、靈敏、快速的高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)血漿中百草枯濃度，可為評(píng)估患者中毒程度，建立百草枯中毒預(yù)后判斷指標(biāo)，評(píng)價(jià)臨床治療方案效果提供方法學(xué)支持。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 福立 FL2200Ⅱ高效液相色譜儀，配有色譜工作站；eppendorf AG22331 minispin plus高速臺(tái)式離心機(jī)；IKA VORTEX genius.3渦旋混合器；梅特勒-托利多 AL-204分析天平；百草枯標(biāo)準(zhǔn)品(上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院 批號(hào)20107038)；1-庚烷磺酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 批號(hào)20110511)；乙腈、甲醇、三乙胺均為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Utimate·XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1 mmol-L-1磷酸緩沖液(含75 mmol·L-1庚烷磺酸鈉)-乙腈(88∶12，三乙胺調(diào)pH=3.0)；流速：1.0 mL/min；柱溫28℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為258 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 精密稱(chēng)取百草枯標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg置于1.0 mL EP管中，以純水溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度為2 000.0 μg·mL-1的百草枯儲(chǔ)備液，4℃冰箱內(nèi)避光儲(chǔ)存。用時(shí)取儲(chǔ)備液用純水逐級(jí)稀釋?zhuān)涑珊俨菘葙|(zhì)量濃度分別為2、20、200 μg·mL-1的百草枯系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品處理 取樣品0.5 mL 置EP管中，加入35%高氯酸100 μL，渦漩1 min，低溫高速13 000 r/min，離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.2.4 方法專(zhuān)一性 分別取空白血漿、200 μg·mL-1百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白血漿+200 μg·mL-1百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測(cè)血漿樣品，按“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，得色譜圖，確定百草枯出峰時(shí)間，排除血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)百草枯測(cè)定的干擾。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)建立 精密吸取百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別加入到空白血漿中，得百草枯濃度為0.2、0.5、2、5、20、50、200、500 μg·mL-1的血漿樣品。照“1.2.3”項(xiàng)下方法操作后，上述色譜條件下進(jìn)行分析，分別以濃度(y)對(duì)峰面積(x)做線(xiàn)性回歸，得血漿百草枯濃度回歸方程，并檢測(cè)百草枯濃度定量下限。

1.2.6 絕對(duì)回收率 于空白血漿中加入適量不同濃度百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使百草枯濃度分別為2、20、200 μg·mL-1，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理，同時(shí)測(cè)定相應(yīng)濃度的百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液。將血漿樣品中與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的百草枯峰面積進(jìn)行比較，測(cè)得絕對(duì)回收率。

1.2.7 相對(duì)回收率 于空白血漿中加入適量不同濃度百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使百草枯濃度分別為2、20、200 μg·mL-1，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份樣本，計(jì)算相對(duì)回收率，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度。

1.2.8 批內(nèi)和批間精密度 以空白血漿配制2、20、200 μg·mL-1濃度梯度的百草枯系列溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理，此為1個(gè)分析批；連續(xù)3天，每天測(cè)定1個(gè)分析批，分別用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算測(cè)得濃度。計(jì)算日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，評(píng)價(jià)方法的精密度。

1.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以空白血漿配制2、20、200μg·mL-1濃度梯度的百草枯系列溶液，按時(shí)間分為原點(diǎn)，-20℃凍融1次，凍融2次，-20℃存放1天，存放7天。按“1.2.3”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行測(cè)定5份樣本，分別用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算測(cè)得濃度，評(píng)價(jià)-20℃凍融與存放時(shí)間百草枯穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果

2.1 方法專(zhuān)一性 在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，血漿中百草枯峰形良好，分離完全，不受血漿內(nèi)雜質(zhì)蜂干擾，百草枯保留時(shí)間為7 min左右，本方法具有較好的專(zhuān)一性，見(jiàn)圖1。

2.2 線(xiàn)性范圍與檢出限 百草枯的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為y=0.000011x-0.9956，r=0.998，y為百草枯的濃度(μg·mL-1)，x為峰面積。表明百草枯在0.2～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。最低檢出限(S/N=3)可達(dá)0.1 μg·mL-1。

2.3 回收率和精密度試驗(yàn) 回收率結(jié)果見(jiàn)表1，平均絕對(duì)回收率為100.6%，RSD均小于3%；平均相對(duì)回收率為101.31%，RSD均小于6%。日內(nèi)和日間精密度見(jiàn)表2，RSD均小于6%。

表1 百草枯回收率(n=5)

表2 百草枯精密度(n=5)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 反復(fù)凍融及凍存不同時(shí)間百草枯樣品濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3、4，三組間及組件兩兩比較無(wú)顯著性差異，P值均大于0.05，RSD均小于8%，表明上述條件下百草枯樣品穩(wěn)定。

表3 百草枯凍融穩(wěn)定性(n=5)

注：與原點(diǎn)比較，◆P>0.05；與凍融1次比較，●P>0.05，三組間比較，P>0.05。

表4 百草枯凍存穩(wěn)定性(n=5)

注：與原點(diǎn)比較，◆P>0.05；與凍存1次比較，●P>0.05，三組間比較，P>0.05。

3 應(yīng)用

患者郭某某，男，32歲，體重72 kg，口服20%百草枯溶液50 mL后半小時(shí)入院。于入院當(dāng)時(shí)，服毒后6、12、24、36、48 h取血漿，按照“1.2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)定血漿中百草枯濃度，血藥濃度時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)患者口服百草枯后，血漿中百草枯濃度會(huì)隨時(shí)間推移而顯著下降，至48 h 后已難以測(cè)出，因此在臨床工作中，要及早進(jìn)行洗胃，導(dǎo)瀉，血液灌流及抗氧自由基等綜合治療，盡最大可能挽救患者生命。

4 討論

百草枯的分子式為C12H14N2，分子量為186.3，純品為白色結(jié)晶，以陽(yáng)離子形式存在，易溶于水，微溶于乙醇，300℃左右分解，在酸性及中性溶液中穩(wěn)定，可被堿水解，常用的為20%水溶液。由于其強(qiáng)極性及高沸點(diǎn)，因而液相色譜法尤其是高效液相色譜法是最常用的百草枯檢測(cè)方法。檢測(cè)效果和具體分析方法因選擇的色譜儀、色譜柱、流動(dòng)相等的不同而異。通常情況下百草枯液相色譜法選用離子對(duì)試劑的流動(dòng)相、富集特性強(qiáng)的色譜柱，更能獲得顯著的分析檢測(cè)結(jié)果[9-10]。百草枯生物樣品的預(yù)處理方法多采用固相萃取法[8]，成本較高且涉及多種化學(xué)試劑，步驟繁雜。本實(shí)驗(yàn)參照Hara 等[11]，王雷等[12]報(bào)道的條件，采用高氯酸直接沉淀蛋白的方法，簡(jiǎn)便快捷，且沉淀完全，在檢測(cè)中未見(jiàn)有干擾組分，且獲得了較高的回收率，從圖1血漿中百草枯色譜圖看，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)多在6 min內(nèi)出峰，不干擾百草枯的測(cè)定。

本方法選用磷酸溶液作緩沖液，庚烷磺酸鈉作離子對(duì)試劑，乙腈為有機(jī)溶劑，同時(shí)用有機(jī)堿三乙胺調(diào)節(jié)pH值。結(jié)果顯示，百草枯峰形良好，保留時(shí)間適當(dāng)，回收率和精密度符合方法學(xué)要求，分析過(guò)程簡(jiǎn)單易行，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在30 min內(nèi)完成。本研究發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相的存放時(shí)間可對(duì)百草枯保留時(shí)間有一定影響，這可能與流動(dòng)相中乙腈揮發(fā)，導(dǎo)致流動(dòng)相中乙腈比例降低有關(guān)。流動(dòng)相中庚烷磺酸鈉的濃度及乙腈比例對(duì)百草枯的保留時(shí)間影響較大，庚烷磺酸鈉濃度降低或乙腈比例升高，都會(huì)使百草枯保留時(shí)間縮短，且有拖尾現(xiàn)象。當(dāng)柱溫為28℃，流動(dòng)相中庚烷磺酸鈉含量為75 mmol·L-1，乙腈體積比為12%時(shí)，百草枯分離良好，同時(shí)避免了血漿中雜峰的干擾，能得到較好色譜圖。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，其靈敏度、專(zhuān)一性、線(xiàn)性范圍、精密度、準(zhǔn)確度等，符合生物樣品分析方法要求，重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于臨床百草枯中毒患者的血藥濃度快速檢測(cè)。

[1] Goel A,Aggarwal P.Pesticide poisoning[J].Natl Med J India,2007,20(4):182-191.

[2] 王生級(jí), 范曉婷,吳偉,等.血必凈注射液對(duì)百草枯中毒短期預(yù)后影響的Meta分析[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2011,18(4):222-224.

[3] 孔慶福, 張華, 王麗, 等. 急性百草枯中毒早期器官損害與細(xì)胞因子的變化[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2010,17(3):159-162.

[4] Senarathna L,Eddleston M,Wilks M F,et al.Prediction of outcome after paraquat poisoning by measurement of the plasma paraquat concentration[J].QJM,2009,102(4):251-259.

[5] de Almeida R M,Yonamine M.Enzymatic-spectrophotometric determination of paraquat in urine samples:a method based on its toxic mechanism[J].Toxicol Mech Methods,2010,20(7):424-427.

[6] Whitehead R D Jr,Montesano M A,Jayatilaka N K,et al.Method for measurement of the quaternary amine compounds paraquat and diquat in human urine using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2010,878(27):2548-2553.

[7] Lanaro R,Costa J L,Fernandes L C,et al.Detection of paraquat in oral fluid,plasma,and urine by capillary electrophoresis for diagnosis of acute poisoning[J].J Anal Toxicol,2011,35(5):274-279.

[8] Baeck S K,Shin Y S,Chung H S,et al.Comparison study of the extraction methods of paraquat in post-mortem human blood samples[J].Arch Pharm Res,2007,30(2):235-239.

[9] Zou Y,Shi Y,Bai Y,et al.An improved approach for extraction and high-performance liquid chromatography analysis of paraquat in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011,879(20):1809-1812.

[10] Ito M,Hori Y,Fujisawa M,et al.Rapid analysis method for paraquat and diquat in the serum using ion-pair high-performance liquid chromatography[J].Biol Pharm Bull,2005,28(4):725-728.

[11] Hara S,Sasaki N,Takase D,et al.Rapid and sensitive HPLC method for the simultaneous determination of paraquat and diquat in human serum[J].Anal Sci,2007,23(5):523-526.

[12] 王雷,王本杰,孔祥麟, 等.高效液相色譜法測(cè)定大鼠血漿中百草枯的含量[J].藥物分析雜志,2009,29(4):623-626.

HPLC determination of paraquat concentration in human plasma

SUN Bin LUAN Chunye GUO Lisha ZHUANG Fuju XIA Juanjuan QIU Jianqing

Department of Emergency,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603，P.R.China

Objective To establish an HPLC method for determination of paraquat in human plasma to provide methodology support for the assessment of prognosis and choice of therapy of patients with paraquat poisoning.Methods The plasma samples were deproteimized with 35% perchlorld acid.The mobile phase consisted of 0.1 mol·L-1phosphate buffer (75 mmol·L-1sodium heptanesulfonate)-acetonitrile (88:12), adjusted pH to 3.0 by triethylamine,at a flowrate of 1.0 mL·min-1,and the detection occurred at 258 nm, column temperature at 28℃.Results A good linearity was obtained in the concentration range of 0.2～500 μg·mL-1.The average absolute recovery was 100.6%,RSD were less than 3%,average relative recovery was 101.31%,RSD less than 6%.The intra-day and inter-day RSD were less than 6%. After thawing and frozen,concentration of paraquat showed no significant difference.Conclusion HPLC method was rapid, accurate and without interference of impurities, which could be applied in analysis and determination of plasma concentration for patients with paraquat poisoning.

paraquat,HPLC,plasma concentration

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0307)

邱建清,E-mail: sbalyf@163.com

孫 斌 欒春業(yè) 郭麗莎 莊福聚 夏娟娟 邱建清

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科 濱州 256603

R 595.9

A

1001-9510(2016)05-0342-04

2016-06-21)