Cullin 4B在結(jié)直腸癌中表達(dá)與β-catenin關(guān)系及臨床意義

李圣陶 周逢強(qiáng) 徐 宏 張 建

1 濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 煙臺(tái) 264003；2 濱州市人民醫(yī)院普外二科；3 濱州市人民醫(yī)院病理科

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Cullin 4B在結(jié)直腸癌中表達(dá)與β-catenin關(guān)系及臨床意義

李圣陶1周逢強(qiáng)2徐 宏2張 建3

1 濱州醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院 煙臺(tái) 264003；2 濱州市人民醫(yī)院普外二科；3 濱州市人民醫(yī)院病理科

目的 研究Cullin 4B(Cul4B)在結(jié)直腸癌中表達(dá)情況及其臨床意義，探討其表達(dá)與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測83例結(jié)直腸癌組織、正常結(jié)直腸組織中Cul4B的表達(dá)，同時(shí)檢測83例結(jié)直腸癌組織中β-catenin的表達(dá)情況。結(jié)合臨床病理情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 83例結(jié)直腸癌組織中Cul4B高表達(dá)率為74.7%，顯著高于正常結(jié)直腸組織中的高表達(dá)率(39.8%，P<0.05)，且Cul4B高表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。β-catenin在結(jié)直腸癌中陽性率為66.3%，與Cul4B表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.464，P<0.01)。結(jié)論 Cul4B在結(jié)直腸癌中表達(dá)與β-catenin呈正相關(guān)。

cullin4B;β-catenin;結(jié)直腸癌

Cullin4B(CUL4B)屬于Cullin基因家族，該家族成員是泛素連接酶(ubiquitin ligase)E3的重要組成部分，在蛋白的泛素化過程中發(fā)揮重要的功能。哺乳動(dòng)物中Cullin4有兩種同源蛋白，分別是CUL4A和CUL4B，兩者的主要區(qū)別在N端，CUL4B的N端含有核定位信號(hào)，從而使CUL4B主要分布于細(xì)胞核內(nèi)。CUL4作為骨架蛋白參與組成Cullin 4-Ring E3泛素連接酶復(fù)合物，調(diào)控細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、胚胎發(fā)育等多種重要生命活動(dòng)[1]。近年來研究表明CUL4B在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[2-4]。β-catenin是重要的細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架成份，同時(shí)又是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)重要組成部分。研究表明，結(jié)腸癌的發(fā)生與Wnt/β-catenin通路的異常有關(guān)，特別是β-catenin蛋白及基因的異常表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞增殖的相關(guān)轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生。筆者采用免疫組織化學(xué)方法檢測CUL4B的表達(dá)及其臨床意義，并探討其與β-catenin的表達(dá)相關(guān)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 選取2015年1月—2016年1月在山東省濱州市人民醫(yī)院胃腸外科行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者83例，其中男48例，女35例，年齡在35～86歲之間，平均年齡為65歲，其中直腸癌患者39例，結(jié)腸癌患者44例。所有患者術(shù)前均未接受化放療和其他免疫治療，有吸煙史患者63例，無吸煙史患者20例，腫瘤直徑>3 cm 60例，腫瘤直徑≤3 cm 23例。按照TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ期 15例，Ⅱ 30例，Ⅲ 31例，Ⅳ 7例。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移48例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移7例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移76例。同時(shí)取距腫瘤邊緣5 cm處正常結(jié)直腸組織83例作為對照組。

1.2 主要試劑 CUL4B兔抗人多克隆抗體(SIGMA公司，USA)，β-catenin抗體即用型(福州邁新試劑公司)。免疫組織化學(xué)法檢測試劑盒、檸檬酸抗原修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液(PBS)及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 所有標(biāo)本離體后按照常規(guī)的組織病理方法盡快去除過多血跡和污染物，常規(guī)固定、脫水及石蠟包埋行厚4 μm連續(xù)切片，用二步法免疫組化染色，CUL4B一抗的工作濃度為1∶200，β-catenin一抗為即用型。常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)，一抗和二抗分別孵育、二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片觀察。用已知陽性的切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為陰性對照。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 根據(jù)文獻(xiàn)[5]，β-catenin 在正常的結(jié)直腸組織粘膜主要表達(dá)于細(xì)胞膜，在細(xì)胞核、細(xì)胞漿表達(dá)很少，而在結(jié)直腸癌組織中，則主要為瘤細(xì)胞胞漿的異位表達(dá)。β-catenin 陽性表達(dá)為細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，陰性細(xì)胞胞漿無棕黃色顆粒，以正常細(xì)胞膜表達(dá)為β-catenin 陰性，以細(xì)胞膜表達(dá)缺失或出現(xiàn)異位表達(dá)為β-catenin 陽性。CUL4B為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，采用半定量法，結(jié)合染色強(qiáng)度及染色范圍評判染色結(jié)果：淡棕色為1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細(xì)胞數(shù)≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～74%為3分，≥75%為4分；將染色強(qiáng)度與染色范圍結(jié)果分別計(jì)分后相乘，所得分?jǐn)?shù)為最終評分，分?jǐn)?shù)范圍0～12分。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，規(guī)定CUL4B的評分0分為陰性表達(dá)，≥1為陽性，1～6分為低表達(dá)，7～12分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。其中計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，數(shù)值相關(guān)性采用Spearman檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組織及癌組織中CUL4B表達(dá)結(jié)果 Cul4B主要表達(dá)于細(xì)胞核，在正常組織及癌組織中普遍表達(dá)，正常組織及癌組織陽性率都為100%，其中正常組織中低表達(dá)50例(60.2%)，高表達(dá)33例(39.8%)。癌組織陽性率100%，其中低表達(dá)21例(25.3%)，高表達(dá)62例(74.7%)。見表1及圖1。

表1 cul4B在結(jié)直腸癌及正常組織中表達(dá) / 例(率)

注：χ2=20.7，P<0.01。

2.2 Cul4B表達(dá)與其臨床病理特征的關(guān)系 Cul4B在結(jié)直腸癌中表達(dá)與腫瘤的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，其中，Cul4B高表達(dá)率在TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期患者(94.7%)高于Ⅰ-Ⅱ期患者(60%)，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.592,P=0.000)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.963,P=0.003)；與其他臨床病理特征無相關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 Cul4B在結(jié)直腸癌中表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 / 例

2.3 Cul4B表達(dá)與β-catenin表達(dá)相關(guān)性 本實(shí)驗(yàn)β-catenin 異位表達(dá)免疫組織化學(xué)染色主要定位于細(xì)胞胞漿，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，本實(shí)驗(yàn) 83 例結(jié)直腸癌組織中β-catenin 異位表達(dá) 55 例，異位表達(dá)為陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為66.3%(55/83)。與Cul4B表達(dá)水平聯(lián)合分析結(jié)果顯示，在Cul4B高表達(dá)的62例病例中，有49例腫瘤組織中β-catenin呈現(xiàn)陽性表達(dá)；而在21例Cul4B低表達(dá)的腫瘤組織中，僅有6例腫瘤組織顯示β-catenin陽性表達(dá)，Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)結(jié)果顯示Cul4B與β-catenin表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.464，P<0.01)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，在Cul4B高表達(dá)組中，β-catenin的高表達(dá)率為79.0% (49/62)；在Cul4B低表達(dá)組中β-catenin的高表達(dá)率為28.6% (6/21)，差異有顯著性(χ2=17.868，P<0.05)。見表3及圖2。

表3 Cul4B與β-catenin在結(jié)直腸癌中表達(dá)相關(guān)性分析

注：χ2=17.87，P<0.01。

3 討論

CUL4做為骨架蛋白參與組成Cullin 4-Ring E3泛素連接酶復(fù)合物,調(diào)控包括細(xì)胞周期、DNA損傷修復(fù)、胚胎發(fā)育等多種重要生命活動(dòng)[1]。Hu等[6]發(fā)現(xiàn)CUL4B通過誘導(dǎo)PRC2介導(dǎo)H3K27的三甲基化，抑制p16和PTEN一系列基因的表達(dá)，與食管癌的發(fā)生有關(guān)。Jiang等[7]在大量的結(jié)腸癌臨床樣本中證實(shí)CUL4B在結(jié)腸癌腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，后續(xù)研究顯示CUL4B的表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度、血管侵犯及病人的生存期相關(guān)。Yuan等[8]證實(shí)在肝細(xì)胞癌中CUL4B協(xié)同PRC2復(fù)合物轉(zhuǎn)錄抑制AXIN2、DKK1、PPP2R2B及PPP2CB的表達(dá)，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin通路，進(jìn)一步促進(jìn)肝癌的發(fā)生。但是Ikuta等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CUL4B/AhR通過介導(dǎo)β-catenin的泛素化降解發(fā)揮抑瘤因子的作用。這就提示我們，CUL4B在不同類型腫瘤中所起的作用可能是不同的。

β-catenin是一重要的細(xì)胞粘附分子和細(xì)胞骨架成份，同時(shí)又是Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)重要組成部分，β-catenin在發(fā)育過程中指導(dǎo)機(jī)體的正常發(fā)育[10]。腫瘤細(xì)胞中β-catenin結(jié)構(gòu)或功能異常，一方面使腫瘤細(xì)胞粘附能力下降，遷移能力增強(qiáng)；另一方面胞漿內(nèi)積聚的β-catenin入核刺激癌細(xì)胞增殖，從而激活許多基因的轉(zhuǎn)錄。Hugh等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者β-catenin異位表達(dá)率明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移者，提示β-catenin異位表達(dá)與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。另有研究表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞核β-catenin表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[12-13]。Diab等[14]研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度相關(guān)。魏永長等[15]及文彬等[16-17]相關(guān)研究顯示β-catenin 蛋白異常表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、 臨床病理分期以及浸潤深度有關(guān)。

本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測發(fā)現(xiàn)，CUL4B在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，而在正常結(jié)直腸組織中以低表達(dá)為主。CUL4B在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TNM分期為Ⅲ-Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組織中CUL4B高表達(dá)。以上結(jié)果表明，CUL4B表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移具有明顯的關(guān)系。同時(shí)結(jié)直腸癌中β-catenin表達(dá)與CUL4B的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，而且聯(lián)系較為密切。由于目前關(guān)于CUL4B在結(jié)直腸癌中的具體作用機(jī)制尚不明確，筆者認(rèn)為CUL4B結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制可能與β-catenin相關(guān)，兩者之間具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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The expression of Cullin 4B and its relationship between β-catenin and its clinical significance in colorectal cancer

LI Shengtao1ZHOU Fengqiang2XU Hong2ZHANG Jian3

1 Clinical College,Binzhou Medical University,Yantai 264003，P.R.China; 2 Second Department of General Surgery, Binzhou City People's Hospital; 3 Department of Pathology, Binzhou City People's Hospital

Objective To discuss Cullin 4B expression and its clinical significance in colorectal cancer,and to investigate the correlation between its expression and β-catenin expression.Methods Immunohistochemistry method was used to detect 83 cases of colorectal cancer tissues and normal colorectal tissues Cul4B the simultaneous detection of the expression of 83 cases of colorectal cancer tissues of β-catenin.Clinical pathology was analyzed statistically.Results Eighty-three cases of colorectal cancer tissues Cul4B expression was 74.7%,significantly higher than in normal colorectal tissue high expression rate (39.8%,P<0.05),and Cul4B expression is closely related to TNM stage and lymph node metastasis.β-catenin in colorectal cancer positive rate of 66.3%,was positively correlated with the expression of Cul4B (r=0.464,P<0.01).Conclusion Cul4B expression in colorectal cancer was positively correlated with β-catenin expression in colorectal cancer.

cullin4B,β-catenin, colorectal cancer

徐宏,E-mail: bzxuhong@163.com

R656.9

A

1001-9510(2016)05-0338-04

2016-06-01)