HAV RT-PCR檢測方法的建立及其在豬群中的流行調(diào)查

艾志瓊，張　玲，2，李麗娟，李　澤，王云紅，申元英*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000；2.自貢市疾病預(yù)防控制中心，四川自貢643000；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

HAV RT-PCR檢測方法的建立及其在豬群中的流行調(diào)查

艾志瓊1，張玲1，2，李麗娟3，李澤1，王云紅1，申元英1*

（1.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000；2.自貢市疾病預(yù)防控制中心，四川自貢643000；3.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000）

目的：了解屠宰生豬中甲型肝炎的流行情況，探討豬作為HAV另一宿主和攜帶者的可能性，以期為人類甲肝的防治提供一定的理論依據(jù)。方法：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法對大理地區(qū)屠宰生豬血清中HAV IgG檢測，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）對屠宰生豬的全血和膽汁標(biāo)本進(jìn)行HAV RNA檢測，以甲型肝炎患者的血液和膽汁為陽性對照標(biāo)本。結(jié)果：①屠宰豬血清樣本中檢測出HAV的抗體陽性率為73.3%（374/510）；②建立了甲型肝炎病毒的RT-PCR檢測方法；③用RT-PCR在陽性對照標(biāo)本中檢出HAV RNA；④用RT-PCR在屠宰豬的全血和膽汁樣本中未檢出HAV RNA。結(jié)論：成功建立起RTPCR檢測待測樣本中的HAV RNA的方法；屠宰豬血清樣本中檢測出HAV的抗體陽性率較高；豬是否可以感染人的HAV還有待于進(jìn)一步研究。

HAV；屠宰生豬；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；大理地區(qū)

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.10.022

甲型肝炎（Hepatitis A，HA）是由甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）引起的一種急性病毒性肝炎，是急性病毒性肝炎中感染率和發(fā)病率最高的一種〔1-2〕，是一種世界范圍流行的常見腸道傳染病。我國是甲型肝炎的高發(fā)地區(qū)之一，甲型肝炎已成為我國的一個(gè)重要公共衛(wèi)生問題，越來越受到人們的重視〔3-4〕。1981年，詹美云等報(bào)道，HAV感染樹鼩后在其體內(nèi)檢測出相關(guān)抗原抗體，近年來，屠宰豬血清中檢出抗-HAV亦有報(bào)道〔5-6〕。這些研究表明，HAV除了能感染黑猩猩、恒河猴等靈長類動物，HAV也可能感染非靈長類動物。本研究用醫(yī)用HAV診斷試劑盒檢測屠宰豬血清中HAV標(biāo)志物，以了解HAV在屠宰豬中的血清流行狀況；用人HAV基因序列擴(kuò)增屠宰豬HAV核苷酸序列以確定豬體內(nèi)是否存在HAV的感染，由此探討豬作為HAV另一宿主和攜帶者的可能性，以期為人類甲肝的防治提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1樣本收集大理地區(qū)屠宰場屠宰生豬血清、全血各510份（每頭豬采血6 mL×2管，統(tǒng)一編號，其中1管用于分離血清，1管抗凝用于收集全血），收集膽囊176個(gè)，獲取膽汁176份；收集大理州各醫(yī)院甲肝患者的血液27份和膽汁32份，將擴(kuò)增出目的條帶的標(biāo)本作為陽性對照。

1.2主要實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1甲肝病毒來自凍干甲型肝炎減毒活疫苗。該疫苗是將甲型肝炎病毒H2減毒株接種于人倍體細(xì)胞KMB17株，經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、提取病毒，加穩(wěn)定凍干劑制成。由大理市疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2.2引物選取保守的VP3-VP1區(qū)的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，序列如下，上游引物P1∶5’-CCTT-GAGATTTCGTGTTC-3’，下游引物P2∶5’-CCTATTGGCTTTCCCTTT-3’，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增的目的片段長度為347 bp。

1.2.3試劑盒TRNzol-A+總RNA提取試劑，北京TIANGEN公司。RevertAidFirstStrandcDNAsynthsis Kit、RT-PCR試劑盒、PCR Master Mix試劑盒均購自Thermo公司。

1.3方法

1.3.1血清學(xué)檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法對血清中HAV IgG檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.2HAV疫苗復(fù)活備用將疫苗稀釋劑加入凍干粉劑后，可見澄明液體，1.0 mL中含甲型肝炎活病毒不低于6.5l g CCID50。

1.3.3核酸提取直接取病毒懸液（新鮮血液或膽汁上清）0.25 mL，加入0.75 mL TRNzol-A+，充分振蕩混勻，將樣品在室溫放置5 min；加入0.15 mL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，4℃條件下12 000 r/min離心10 min，樣品分為3層∶黃色有機(jī)相，中間層和上層無水相，RNA主要溶于水相中，把水相轉(zhuǎn)移到新管中，在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置30 min；4℃條件下12 000 r/min離心10 min，去上清，加入0.75 mL 75%乙醇對沉淀進(jìn)行洗滌；4℃條件下12 000 r/min離心5 min，去上清。室溫放置晾干，加入100 μL RNase-free dd H2O，反復(fù)吹打、混勻，充分溶解RNA。隨即進(jìn)行RT或-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4RT-PCR擴(kuò)增條件的摸索RT反應(yīng)的摸索∶使用MMLV和AMV反轉(zhuǎn)錄酶分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；PCR擴(kuò)增條件的摸索∶退火溫度42～55℃，引物濃度從10～30 μmol/L，循環(huán)參數(shù)25～35。

1.3.5PCR產(chǎn)物的檢測PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖，TAE電泳緩沖液，100 V 60 min電泳后用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，以產(chǎn)物中出現(xiàn)347 bp條帶的樣品為陽性。

2　結(jié)果

2.1血清學(xué)檢測結(jié)果收集屠宰生豬血清510份，HAV-lgG陽性374份，陽性率73.3%。

2.2建立了甲型肝炎病毒的RT-PCR檢測方法反轉(zhuǎn)錄∶RT反應(yīng)采用20 μL體系，其組成如下∶模板RNA 7 μL，引物P2（10 μmol/L）2 μL，RNase-free ddH2O 3 μL，65℃5 min后立即冰上冷卻；后繼續(xù)添加5×Reaction Buffer 4 μL，Ribolock RNase抑制劑（20 U/μL）1 μL，dNTP mix（10 mm）2 μL，Revert Aid M-Mulv-RT（200 U/μL）1 μL。RT反應(yīng)條件42℃60 min后70℃5 min。

PCR反應(yīng)∶PCR反應(yīng)體系采用50 μL體系，其組成如下∶10×PCR Buffer 5 μL、dNTP mix（10mM）1 μL、引物P1（10 μmol/L）1.5 μL、引物P2（10 μmol/L）1.5 μL、Taq酶0.25 μL、模板（cDNA）4 μL，ddH2O 36.5 μL。反應(yīng)條件為∶95℃預(yù)變性，5 min；進(jìn)入循環(huán)94℃30 s→47℃30 s→70℃，30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，最后4℃保存。用甲型肝炎減毒疫苗作為實(shí)驗(yàn)樣本，經(jīng)上述RT-PCR反應(yīng)后電泳圖。見圖1。

圖1　甲型肝炎減毒疫苗RT-PCR電泳結(jié)果

2.3陽性對照RT-PCR結(jié)果運(yùn)用建立的RT-PCR方法對收集的甲肝患者的27份血液和32份膽汁標(biāo)本進(jìn)行HAV RNA檢測，有2份血液標(biāo)本和1份膽汁標(biāo)本成功擴(kuò)增出目的條帶，見圖2。將此兩份血液標(biāo)本和1份膽汁標(biāo)本作為陽性對照。

2.4豬血液和膽汁中HAV RNA檢測結(jié)果運(yùn)用建立的甲型肝炎病毒的RT-PCR方法對屠宰生豬的血液和膽汁標(biāo)本，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后電泳結(jié)果未見任何條帶。見圖2。

圖2　屠宰生豬甲肝病毒PCR產(chǎn)物電泳圖

3　討論

在甲肝血清標(biāo)志物中抗HAV-IgM是新近感染的標(biāo)志，一般在發(fā)病后3～6個(gè)月轉(zhuǎn)陰，是早期診斷甲型肝炎最簡便和最可靠的血清學(xué)標(biāo)志。抗HAVIgG屬于保護(hù)性抗體，是機(jī)體具有免疫力的標(biāo)志，一般在體內(nèi)可持續(xù)多年或終身，HAV-IgG抗體陽性，提示接種過甲肝疫苗或以往感染過甲肝病毒，具有流行病學(xué)意義，可為制定有效、合理的預(yù)防措施提供科學(xué)依據(jù)〔7-10〕。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)大理地區(qū)屠宰生豬的HAV-lgG陽性率為73.3%，提示大多數(shù)屠宰豬通過自然感染獲得了自身免疫，說明HAV在屠宰生豬中有較高的流行率。

PCR是具有高特異性和敏感性，是檢測病毒常用的一種方法〔11-12〕。本研究用甲肝減毒活疫苗作為研究樣本，成功建立起RT-PCR來檢測方法，已分別從樣人血液和膽汁標(biāo)本中提取HAV RNA，并通過RT-PCR擴(kuò)增出HAV目的基因片段，說明以血液和膽汁作為HAV RNA檢測的標(biāo)本是可行可靠的。但本研究未能在屠宰生豬血液和膽汁標(biāo)本中擴(kuò)增出目的基因，可能原因有∶一是豬源HAV與人類HAV基因序列差異較大，用人類HAV的引物無法擴(kuò)增出目的基因。諸多研究已表明人類HAV具有一定程度的核苷酸和氨基酸異質(zhì)性〔13-15〕。這些研究表明甲肝病毒如同其它RNA病毒一樣，在生物體內(nèi)存在密切相關(guān)的變異株分布。王昊〔16〕通過對不同甲型肝炎患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同患者各基因片段核苷酸變異率相差較大?？梢姡琀AV在同物種不同個(gè)體間核苷酸變異較大，在不同物種間的基因序列差異較大也是可能的。另一種可能原因是甲型病毒性肝炎不是一種人畜共患病，豬不會感染人類甲型肝炎病毒。豬的血清中HAV-lgG陽性的出現(xiàn)可能是因?yàn)樨i的細(xì)胞上有類似甲型肝炎病毒的抗原決定簇，導(dǎo)致HAV-lgG檢測出現(xiàn)假陽性〔16〕。

目前，對HAV在不同物種間的研究甚少。本研究HAV血清學(xué)檢測結(jié)果顯示豬源HAV-lgG陽性率雖較高，但缺少分子生物學(xué)相關(guān)證據(jù)，因此，對于豬是否可以感染人類甲型肝炎病毒還有待于進(jìn)一步的研究，甲型病毒性肝炎是否像戊型病毒性肝炎一樣〔17〕，是一種人畜共患疾病，也有待于不同物種間HAV的深入研究。

〔1〕溫群文，陳輝，段永，等.深圳市南山區(qū)健康人群HAVIgG抗體水平調(diào)查〔J〕.預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2005，21（4）：447-448.

〔2〕雷明玉，周敬祝，蔣家立，等.一起甲肝暴發(fā)疫情的流行病學(xué)調(diào)查〔J〕.醫(yī)學(xué)動物防制，2015，31（6）：659-664.

〔3〕寧桂軍，程萱芹，陳園生，等.貴州省旱災(zāi)期間一起甲型病毒性肝炎爆發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查〔J〕.中國疫苗和免疫，2013，10（5）：435-438.

〔4〕陳靜，程慧健，張麗杰，等.江西省一起因飲用受污染的井水導(dǎo)致甲型肝炎暴發(fā)調(diào)查〔J〕.中華流行病學(xué)雜志，2011，32（10）：1014-1017.

〔5〕張玲.甲型肝炎病毒在屠宰豬中感染情況調(diào)查〔D〕.大理：大理大學(xué)，2013.

〔6〕李麗娟，申元英，艾志瓊，等.豬源甲、乙、戊型肝炎病毒血清流行病學(xué)調(diào)查〔J〕.四川生理科學(xué)雜志，2012，34（3）：103-105.

〔7〕安婧，李慧，張曉曙，等.甘肅省重點(diǎn)地區(qū)15歲以下兒童甲型病毒性肝炎流行情況〔J〕.中國社會醫(yī)學(xué)雜志，2015，32（5）：327-359.

〔8〕劉重程，唐雅清，隋吉林，等.北京市昌平區(qū)自然人群甲型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果分析〔J〕.中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2013，14（7）：557-558.

〔9〕路滟，廖玉學(xué)，董書賢，等.深圳市甲型病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查〔J〕.中華疾病控制雜志，2015，19（6）：631-634.

〔10〕趙曉敏，樊向云，周文亭，等.烏拉特前旗11-20歲人群甲型病毒性肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查〔J〕.中國疫苗和免疫，2014，20（6）：533-535.

〔11〕徐德順，朱曉娟，陳莉萍，等.輪狀病毒星狀病毒和甲型肝炎病毒的單管多重?zé)晒舛縍T—PCR檢測方法研究〔J〕.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，27（4）：357-361.

〔12〕衛(wèi)海燕，黃學(xué)勇，許玉玲，等.EV71病毒核酸快速檢測方法的比較〔J〕.病毒學(xué)報(bào)，2012，2（6）：670-673.

〔13〕SANCHEZ G，BOSCH A，GOMEZ-MARIANO G，et al. Evidence for qiiasispecies distributions in the human hepatitis A virus genome〔J〕.Virology，2003，315（1）：34-42.

〔14〕SULBARAN Y，GUTIERREZ C R，MARQUEZ B，et al. Hepatitis A virus genetic diversity in Venezuela：exclusive circulation of subgenotype lA and evidence of quasispecies distribution in the isolates〔J〕.Journal of medical virology，2010，82（11）：1829-1834.

〔15〕COSTA-MATTIOLI M，DOMINGO E，CRISTINA J.Analysis of sequential hepatitis A virus strains reveals coexistence of distinct viral subpopulations〔J〕.The JoumaI of general virology，2006，87（1）：115-118.

〔16〕王昊.我國甲肝病毒流行株全基因組序列分析及準(zhǔn)種變異研究〔D〕.北京：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，2014.

〔17〕朱光澤.戊型肝炎流行病學(xué)和戊型肝炎病毒全基因克隆與表達(dá)研究〔D〕.吉林：吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，2007.

Establishment of Hepatitis A Virus RT-PCR Detection Method and Its Epidemiological Investigation in Swinery

Ai Zhiqiong1，Zhang Ling1，2，Li Lijuan3，Li Ze1，Wang Yunhong1，Shen Yuanying1*
（1.College of Public Health，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Disease Control and Prevention Centers of Zigong，Zigong，Sichuan 643000，China；3.Pre-clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective:To study the epidemic state of the Hepatitis A Virus（HAV）infection in swinery，and to explore the possibility of swine as another host or carrier of HAV for providing basis for prevention and controlling measures of human HA.Methods:Serum HAV-IgG of swine in Dali was detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），and HAV-RNA of swine blood and swine bile samples were tested by reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR），with the blood and bile of HAV as positive control.Results:①HAV antibody positive rate of the blood samples of swine were detected as 73.3%（374/510）；②RT-PCR method was built to detect HAV；③HAV-RNA of positive control samples were detected with RT-PCR；④HAV-RNA of swine blood and swine bile samples were not detected with RT-PCR.Conclusion:RT-PCR method is successfully built to detect HAV-RNA.The antibody positive rate of HAV is rather high in the blood sample of swine.Further research is necessary to demonstrate whether the swine could infect human HAV.

Hepatitis A virus（HAV）；swine；Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）；Reverse transcription-Polymerase chain reaction（RT-PCR）；Dali

R512.91

A

2096-2266（2016）10-0081-04

（責(zé)任編輯董杰）

云南省科技廳青年基金資助項(xiàng)目（2012FD035）；云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目基金資助（2013FB060）

2016-03-09

2016-05-02

艾志瓊，講師，主要從事分子流行病學(xué)研究.

*通信作者：申元英，教授.