共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

聶大紅，唐剛?cè)A

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣東省醫(yī)用放射性藥物轉(zhuǎn)化應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放療科，廣東 廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510080)

?

共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

聶大紅1,2，唐剛?cè)A1,3

(1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣東省醫(yī)用放射性藥物轉(zhuǎn)化應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放療科，廣東 廣州 510080；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510080)

共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像(RETI)能顯著改善光信號(hào)強(qiáng)度和組織穿透性，可用于活體深度組織光學(xué)顯像。共振能量轉(zhuǎn)移(RET)是指發(fā)生在近距離的供體與受體之間的能量轉(zhuǎn)移，包括非放射共振能量轉(zhuǎn)移和放射共振能量轉(zhuǎn)移。RETI是基于共振能量轉(zhuǎn)移的光學(xué)成像技術(shù)，主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯像(FRETI)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移顯像(BRETI)、化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移顯像(CRETI)和放射共振能量轉(zhuǎn)移顯像(RRETI)。目前，RETI是分子顯像研究的熱門領(lǐng)域，已用于生物醫(yī)藥學(xué)研究各領(lǐng)域。本文對(duì)RETI技術(shù)原理及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像；熒光共振能量轉(zhuǎn)移；生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移；化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移；放射共振能量轉(zhuǎn)移

隨著生命科學(xué)研究的深入，無論是疾病臨床診療，還是基礎(chǔ)研究，都迫切需要一種高度靈敏、快速、可靠、操作簡(jiǎn)便、易自動(dòng)化的分析技術(shù)。光學(xué)成像(OI)因其高靈敏度、高分辨率、操作簡(jiǎn)單及經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已發(fā)展成為應(yīng)用最為廣泛的分子影像技術(shù)之一，在生物醫(yī)藥學(xué)各研究領(lǐng)域和臨床淺表組織光學(xué)顯像方面發(fā)揮著獨(dú)特作用，并在術(shù)中導(dǎo)向治療方面顯示巨大應(yīng)用前景。傳統(tǒng)OI存在光信號(hào)強(qiáng)度較弱、組織穿透性較差的缺陷，從而限制了進(jìn)一步發(fā)展?；谀芰哭D(zhuǎn)移的光學(xué)成像技術(shù)能顯著改善OI光信號(hào)強(qiáng)度和組織穿透性，倍受人們青睞。共振能量轉(zhuǎn)移(resonance energy transfer, RET)是指發(fā)生在距離足夠近(一般小于10 nm)的供體與受體之間的能量轉(zhuǎn)移，包括非放射共振能量轉(zhuǎn)移[1-7]和放射共振能量轉(zhuǎn)移(RRET)[8-10]。非放射共振能量轉(zhuǎn)移主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)[2,5-7]、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)[2]和化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)[3-4]；RRET包括內(nèi)照射共振能量轉(zhuǎn)移[8-10]和外照射共振能量轉(zhuǎn)移[11]。其中，F(xiàn)RET和外照射共振能量轉(zhuǎn)移需要外部射線或光源激發(fā)，而BRET、CRET、內(nèi)照射共振能量轉(zhuǎn)移由內(nèi)部射線或光源(自發(fā)光)激發(fā)，不需外部射線或光源。

近年來，共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像(RETI)是分子顯像研究的熱點(diǎn)。RETI主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯像(FRETI)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移顯像(BRETI)、化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移顯像(CRETI)[3-4]和放射共振能量轉(zhuǎn)移顯像(RRETI)。本文主要對(duì)RETI技術(shù)原理及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述并展望發(fā)展趨勢(shì)。

1 共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像原理

1948年，F(xiàn)oster提出了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理。FRET的基本原理是當(dāng)供體和受體兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)距離小于10 nm，供體分子吸收一定頻率光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)。在回到基態(tài)前熒光能量通過分子間偶極-偶極作用，以非輻射性能量躍遷方式，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)能量，實(shí)現(xiàn)能量向鄰近受體分子轉(zhuǎn)移，即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移[7,12-13]。通過能量共振轉(zhuǎn)移后供體熒光強(qiáng)度降低，而受體可以發(fā)射強(qiáng)于本身的特征熒光(敏化熒光)，同時(shí)也可延長(zhǎng)熒光壽命[7,12]，實(shí)現(xiàn)活體分子顯像。通過能量共振轉(zhuǎn)移后受體也可能不發(fā)熒光(熒光猝滅)，同時(shí)也伴隨著熒光壽命的相應(yīng)縮短，不利于分子顯像。能量轉(zhuǎn)移效率與供體發(fā)射光譜和受體吸收光譜的重疊程度、供體與受體躍遷偶極的相對(duì)取向、供體與受體之間的距離等因素有關(guān)。FRET發(fā)生必須滿足以下條件：1) 供體和受體之間的距離必須足夠小，一般小于10 nm；2) 供體和受體的發(fā)射偶極子和吸收偶極子的方向具有特異性，為了防止振動(dòng)互相抵消而影響FRET信號(hào)的產(chǎn)生，必須保持在一個(gè)非90度的角度[12]；3) 供體的發(fā)射光譜和受體的激發(fā)(或吸收)光譜必須重疊，而且重疊要小，以降低背景熒光的干擾。

分子發(fā)光的激發(fā)模式除了光致發(fā)光(熒光)外，還有生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光和放射發(fā)光等方式。當(dāng)存在合適能量的受體時(shí)，這些激發(fā)模式可以作為供體光源引發(fā)共振能量轉(zhuǎn)移。根據(jù)其分子發(fā)光的激發(fā)模式的不同，分為生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)、化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)和放射共振能量轉(zhuǎn)移(RRET)。BRET、CRET和RRET不需要外部激發(fā)光源，其共振能量轉(zhuǎn)移原理與FRET相似。共振能量轉(zhuǎn)移效率和供受體間距離的六次方成反比，可用方程式表示[7,14]：

(1)

式中，E為共振能量轉(zhuǎn)移效率，R為供體和受體間的距離，R0為能量轉(zhuǎn)移效率達(dá)到50%時(shí)供體和受體間的距離?；谝陨咸卣骱驮恚舱衲芰哭D(zhuǎn)移技術(shù)可用于分子顯像，實(shí)現(xiàn)共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像(RETI)，基本原理示于圖1。

a——供體和受體能級(jí)躍遷；b——供體和受體間共振能量轉(zhuǎn)移；c——供體發(fā)射光譜和受體激發(fā)(或吸收)光譜；d——熒光顯像和RET顯像圖1 共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像基本原理a——Energy level transition from a donor to an acceptor; b——Resonance energy transfer from a donor to an acceptor；c——Emission spectrum from a donor and excitation spectrum (or absorption spectrum) from an acceptor；d——Fluorescent imaging and RET imagingFig.1 Basic principle of resonance energy transfer molecular imaging

2 共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像

2.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像

FRET具有分析速度快、靈敏度高、選擇性好、無污染或污染小等優(yōu)點(diǎn)。利用生物體自身的熒光或者將有機(jī)熒光染料標(biāo)記到目標(biāo)物上，制成FRET探針，用于核酸檢測(cè)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能分析、免疫分析、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)功能檢測(cè)、糖類分析和藥物分析等方面[6,15]。近年來，熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯像(FRETI)在生物醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用也得到一定發(fā)展。

傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料吸收光譜窄，發(fā)射光譜伴有拖尾，影響供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊程度，存在供體和受體發(fā)射光譜產(chǎn)生相互干擾、熒光壽命短、斯托克斯位移小(易發(fā)生發(fā)光光譜重疊)和能量轉(zhuǎn)移效率低等缺陷，在一定程度上限制了其應(yīng)用[15]。將發(fā)光量子點(diǎn)用于共振能量轉(zhuǎn)移研究，克服了有機(jī)熒光染料的不足之處。納米材料，特別是量子點(diǎn)(QD)的出現(xiàn)，解決了共振能量轉(zhuǎn)移效率和熒光壽命短的缺陷，使FRET得到不斷發(fā)展，極大地推動(dòng)了其在生命科學(xué)中的應(yīng)用[6-7]。另外，一些作為能量受體和反應(yīng)載體的新型納米材料如金納米(AuNPs)、碳納米管、石墨烯、氧化石墨烯(GO)、稀土金屬等[16]的出現(xiàn)，使供受體對(duì)之間的轉(zhuǎn)移距離增大，擴(kuò)大了FRET的應(yīng)用范圍。

目前，一些有機(jī)熒光染料已用于活體FRETI。Zou等[17]構(gòu)建了含供體染料(DiD)和受體染料(DiR)的聚(環(huán)氧乙烷)-b-聚苯乙烯(PEO-PS)納米粒FRET探針(DiD/DiR-PEO-PS)，在此基礎(chǔ)上將油酸包被氧化鐵(IONP)參入DiD/DiR-PEO-PS納米粒中，制成了IONP-DiD/DiR-PEO-PS探針?；铙w裸鼠靜脈給予DiD/DiR-PEO- PS和IONP-DiD/DiR-PEO-PS后不同時(shí)間內(nèi)行FRETI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：FRET比率(即IFRET/(IFRET+IDiD))降低，且DiD/DiR釋放到細(xì)胞膜中較慢，表明無創(chuàng)傷性FRETI可用于研究活體聚合物納米粒藥物釋放[17]。Zhang等[18]將近紅外熒光(NIRF)供體菁染料Cy5連接在含裝載藥物的N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物骨架主鏈上，NIRF受體菁染料Cy7連接在酶敏感寡肽(GFLG)側(cè)鏈末端，構(gòu)建了含Cy5和Cy7的FRET探針2P-Cy5-Cy7。靜脈注射2P-Cy5-Cy7，對(duì)荷A2780 人卵巢腫瘤鼠模型進(jìn)行FRETI。FRET探針在瘤組織高通透性和滯留效應(yīng)下被腫瘤細(xì)胞攝取而積聚在腫瘤中，在組織蛋白酶B(cathepsin B)作用下，酶敏感寡肽GFLG和Cy7間鍵斷裂釋放Cy7，擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中代謝和消除，導(dǎo)致FRET信號(hào)散失。由于相對(duì)分子質(zhì)量的差異，Cy5標(biāo)記大分子(Cy5標(biāo)記含裝載藥物-HPMA的GFLG聯(lián)結(jié)基)清除較慢，而游離Cy7分子清除相對(duì)較快，從而導(dǎo)致Cy5/Cy7摩爾比增加。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，受體分子Cy7越少，腫瘤細(xì)胞中的能量轉(zhuǎn)移也更少，導(dǎo)致ICy5/IIFRET比率增加。而斷裂后形成的Cy5標(biāo)記含裝載藥物-HPMA的GFLG聯(lián)結(jié)基，由于相對(duì)分子質(zhì)量較大，可延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，提高腫瘤攝取，最終增強(qiáng)治療效果。結(jié)果表明，F(xiàn)RETI可用于研究大分子治療劑結(jié)合物的酶反應(yīng)性藥物釋放[18]。Bouchaala等[19]構(gòu)建了含長(zhǎng)烷基鏈和四苯硼酸鹽離子對(duì)的親脂性菁染料Cy5.5LP和 Cy7.5LP納米載體FRET探針，用其對(duì)活體動(dòng)物和荷瘤模型行FRETI，結(jié)果表明，F(xiàn)RETI可用于研究評(píng)估活體納米載體完整性、藥物傳遞以及影像導(dǎo)向外科治療。活體QD-FRETI也有較少報(bào)道，Li等[20]通過靶向基質(zhì)金屬蛋白酶-2 (MMP-2)特異性多肽底物(GPLGVRGKGG)結(jié)合供體QD和受體羅丹明B(RB)或近紅外熒光染料 ICG-Der-02(MPA)，構(gòu)建了體外FRET探針540QD-peptide-RB 和活體FRET探針720QD-peptide-MPA，用其分別對(duì)活體細(xì)胞和荷瘤模型行FRETI，檢測(cè)MMP-2活性。結(jié)果表明，基于QD-FRETI法可高度靈敏和特異地檢測(cè)酶斷裂反應(yīng)活性。AuNPs、碳納米管、石墨烯、氧化石墨烯(GO)、稀土金屬等納米材料已用于細(xì)胞FRETI，但其活體FRETI尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

2.2 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像

BRET與FRET相比，不會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞光敏、沒有熒光團(tuán)的光漂白和自身熒光背景的影響[15]。BRET技術(shù)是基于在某些海生動(dòng)物體內(nèi)存在某種酶共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，并導(dǎo)致能量供體和能量受體之間非放射性的能量轉(zhuǎn)移而設(shè)計(jì)的。BRET的能量供體是發(fā)光酶，主要發(fā)光酶有螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶(renilla luciferase, Rluc)，前者與紅色熒光蛋白(RFP)結(jié)合可提供紅移信號(hào)，但缺乏靈敏性和光譜分辨率；后者克服了前者局限性，應(yīng)用較廣。供體發(fā)光酶(如Rluc)通過催化氧化底物(如腔腸熒光素)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)時(shí)發(fā)射光，受體熒光蛋白或量子點(diǎn)(QD)，在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收供體發(fā)射光，導(dǎo)致受體發(fā)射長(zhǎng)波熒光，產(chǎn)生BRET[21]。產(chǎn)生BRET的必要條件是供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜應(yīng)該互相重疊。BRET技術(shù)主要用于生物大分子蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制、非侵入性活細(xì)胞及活體成像等研究[15]。

BRET大致可分為BRET1、BRET2、eBRET和BRET3四類[21-22]。前三類BRET的供體均為Rluc,其差異為底物和能量受體的不同。BRET1使用的熒光素酶底物為腔腸熒光素-h (coelenterazine h)，能量受體為增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)；BRET2使用的熒光素酶底物為腔腸素衍生物，即深藍(lán)C (deepblue C)，受體為綠色熒光蛋白(GFP)；eBRET使用的熒光素酶底物為熒光素酶底物前體EnduRen，該前體可以在活細(xì)胞內(nèi)被酯酶代謝成腔腸熒光素-h。這三類BRET技術(shù)主要用于研究生物大分子蛋白質(zhì)相互作用，其中eBRET具有較大優(yōu)勢(shì)，但必需在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，仍不能用于活體小動(dòng)物成像[22]。BRET3技術(shù)涉及一個(gè)自身發(fā)光融合蛋白的構(gòu)建，該融合蛋白由供體海腎熒光素酶突變體(Rluc8)和受體紅色熒光蛋白突變體(mOrange)組成。與其他BRET技術(shù)相比，BRET3技術(shù)提高了數(shù)倍光強(qiáng)度，使光輸出發(fā)生最大程度的紅移(發(fā)射波峰為 564 nm)，光譜分辨率大約維持在85 nm。因此，BRET3技術(shù)能用于單個(gè)活細(xì)胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)以及活體小動(dòng)物各種體表和深度組織的顯像[22]。為進(jìn)一步改善BRET3性能，使其更適合于活體小動(dòng)物比率BRET檢測(cè)和深度組織顯像，Dragulescu-Andrasi等[21]對(duì)BRET3技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，以海腎熒光素酶突變體RLuc8和RLuc8.6作為供體，兩種紅色熒光蛋白TagRFP和TurboFP635作為受體，并以合成腔腸素衍生物腔腸熒光素-v(coelenterazine-v)為底物，構(gòu)建了新的發(fā)射紅光BRET體系。結(jié)果表明，改進(jìn)的BRET技術(shù)可用于荷瘤模型深度組織顯像以及在藥物篩選和靶標(biāo)確認(rèn)方面涉及有關(guān)的蛋白質(zhì)間相互作用研究。

BRET技術(shù)主要使用熒光蛋白作為受體，為提高它在細(xì)胞和活體內(nèi)成像的實(shí)用性和靈敏度，需要對(duì)BRET受體的一些特性如Stokes位移能進(jìn)行改善。QD可在大于600 nm的波長(zhǎng)處發(fā)射熒光，且具有較好的生物相容性，容易利用生化方法鍵合到表達(dá)蛋白上，且更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。因而，QD可代替熒光蛋白成為新型BRET受體，并已發(fā)展成為新一類QD-BRET。Rao等[2]通過化學(xué)方法將海腎熒光素酶Luc8偶聯(lián)到QD表面，Luc8催化氧化底物腔腸熒光素，將生物發(fā)光能量轉(zhuǎn)移給QD，導(dǎo)致QD發(fā)射長(zhǎng)波熒光，首次構(gòu)建了以Luc8為供體和QD為受體的QD-BRET新體系，已用于活體動(dòng)物BRETI和蛋白酶活性檢測(cè)。Kamkaew等[23]以小熒光素酶(NLuc)為供體和QD為受體，F(xiàn)urimazine為底物，構(gòu)建了QD-NLuc體系，并偶聯(lián)環(huán)狀肽cRGD為QD-NLuc-cRGD體系，已成功應(yīng)用于活體動(dòng)物內(nèi)淋巴結(jié)和荷瘤模型BRETI。Hsu等[24]建立了一種活體內(nèi)光動(dòng)力學(xué)治療(PDT)的BRET新方法，當(dāng)加入底物腔腸熒光素時(shí)，海腎熒光素酶固定的QD-655(QD-RLuc8)產(chǎn)生BRET現(xiàn)象，QD發(fā)出的光進(jìn)一步活化膠束中包裹的光敏劑Foscan，產(chǎn)生活性氧(ROS)殺死癌細(xì)胞，有效地抑制了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.3 化學(xué)發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像

與FRET不同，CRET與BRET一樣，不需要外部激發(fā)光源。CRET是由化學(xué)發(fā)光(CL)底物作為能量供體，將氧化反應(yīng)產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移給合適的受體分子，是一個(gè)非輻射能量轉(zhuǎn)移過程。主要化學(xué)發(fā)光體系有魯米諾(Luminol)、吖啶酯化合物、過氧化草酸酯等，其中Luminol是化學(xué)發(fā)光體系中最為廣泛研究與應(yīng)用的試劑。一般情況下，在合適氧化劑(如鐵氰化鉀、過氧化氫、高錳酸鉀、高碘酸鉀等)和堿性水溶液條件下，可將Luminol 氧化轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)，隨后回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光最大波長(zhǎng)為425 nm[15]。傳統(tǒng)CRET主要使用小分子熒光染料作為能量受體，其斯托克斯位移差異小，供受體對(duì)發(fā)射光譜容易發(fā)生重疊，CRET轉(zhuǎn)移效率低。一些納米材料如多聚納米粒、QD、AuNPs、石墨烯等作為能量受體，由于具有較大的Stokes位移和較高的能量轉(zhuǎn)移效率，使CRET得到了極大地發(fā)展，并在蛋白質(zhì)和核酸分析以及活體動(dòng)物顯像等領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[15]。

QD相對(duì)于有機(jī)熒光團(tuán)具有更長(zhǎng)的激發(fā)壽命，將QD作為CRET的受體，有機(jī)熒光團(tuán)作為供體產(chǎn)生CRET引起了研究者極大興趣，但活體QD-CRETI報(bào)道仍較少。Huang等[28]于2006年以QD為能量受體和Luminol為能量供體，構(gòu)建了QD-辣根過氧化物酶(HRP)催化Luminol-H2O2的CL體系，首次建立了QD-CRET分析方法，提出了該催化體系的CL反應(yīng)機(jī)理為化學(xué)發(fā)光能量轉(zhuǎn)移(CRET)。此后，Zhang等[29]以QD為能量受體和Luminol為能量供體，構(gòu)建了QD和Luminol混合物(Luminol-R)的CL體系，將該混合物體系注射到荷肺炎或轉(zhuǎn)移性癌癥鼠模型體內(nèi)，首次實(shí)現(xiàn)了活體動(dòng)物QD-CRET顯像，成功地檢測(cè)出深度組織髓過氧物酶(MPO)活性，明顯優(yōu)于檢測(cè)MPO活性的Luminol-生物發(fā)光顯像法。為減少Q(mào)D細(xì)胞毒性，Lee等[30]以PEG化的QD(PEG-QD)為能量受體，以具有CL強(qiáng)度比Luminol高100倍的luminol衍生物(L012)為能量供體，在PEG-QD表面修飾L012，設(shè)計(jì)合成了H2O2-響應(yīng)的雜交納米粒探針(HNPs)，對(duì)荷瘤模型和炎癥模型進(jìn)行了CRETI，取得了較好效果。

2.4 放射共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像

利用放射性核素衰變所產(chǎn)生的帶電粒子在生物組織中產(chǎn)生切倫科夫輻射(CR)，對(duì)其發(fā)射的紫外光到可見光波段進(jìn)行光學(xué)成像探測(cè)，即為切倫科夫光學(xué)成像(cerenkov luminescence imaging, CLI)[10]。CLI出現(xiàn)后，使用單一放射性核素標(biāo)記分子探針可同時(shí)進(jìn)行CLI和核素顯像雙模式成像，推動(dòng)了多模式成像技術(shù)的發(fā)展。但是，CLI光信號(hào)強(qiáng)度弱和組織穿透性較差。為解決這些難題，利用CR激發(fā)熒光團(tuán)，將CR光信號(hào)轉(zhuǎn)換為信號(hào)和穿透性更強(qiáng)的紅外波段光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)CR-RETI，進(jìn)而發(fā)展為RRETI，從而解決了CLI存在的問題。RRET基本原理與FRET類似，但以放射性同位素衰變(或X射線)為能量供體和熒光團(tuán)為能量受體，涉及高能粒子通過某種介質(zhì)誘導(dǎo)瞬時(shí)偶極矩，從而實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移[10-11]。外照射共振能量轉(zhuǎn)移顯像主要由X射線激發(fā)稀土納米探針如Eu3 +納米粒引起發(fā)光，實(shí)現(xiàn)活體光學(xué)成像，包括X射線輻射致切倫科夫光成像(X-CLI)[11]和X射線輻射致發(fā)光成像(X-Radioluminescence imaging，X-RLI)[31-32]。內(nèi)照射共振能量轉(zhuǎn)移顯像主要有切倫科夫輻射共振能量轉(zhuǎn)移成像(CRRETI)[10]、多種放射性致發(fā)光成像(MR-RLI)[33]和γ-射線輻射致發(fā)光成像(GR-RLI)[34-35]。RRETI已在腫瘤診斷、療效評(píng)價(jià)、靶區(qū)確定和導(dǎo)向治療等方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。

RRETI受體主要有QD、金納米粒和稀土納米粒。Dothager等[10]采用QD納米粒的斯托克斯效應(yīng)，以18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-FDG)為能量供體和QD為能量受體，在2010年首先建立了切倫科夫輻射共振能量轉(zhuǎn)移顯像(CRRETI)技術(shù)，獲得了在生物體內(nèi)產(chǎn)生切倫科夫光紅移成波長(zhǎng)更長(zhǎng)的熒光，也增加了切倫科夫光信號(hào)的組織穿透性。同年，Liu等[33]以發(fā)射β和γ射線的131I為供體和QD為受體，用發(fā)射寬連續(xù)波長(zhǎng)131I內(nèi)激發(fā)致QD發(fā)光，構(gòu)建了多種放射性照射量子點(diǎn)光學(xué)成像，對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行MR-RLI，進(jìn)一步豐富了內(nèi)照射共振能量轉(zhuǎn)移顯像理論。Boschi等[36]以發(fā)射純?chǔ)律渚€32P-ATP為供體和QD為受體，研究了放射性核素與量子點(diǎn)之間的相互作用機(jī)制，結(jié)果顯示，放射性核素衰變產(chǎn)生的β射線和切倫科夫光都能夠激發(fā)QD，實(shí)現(xiàn)了QD的雙重激發(fā)，證實(shí)了β射線激發(fā)QD過程中也存在BRET中易忽視的自由激發(fā)光產(chǎn)生熒光(FUEL)機(jī)理。大多QD-CRRET系統(tǒng)是基于CL源和QD間的隨機(jī)相互作用，會(huì)導(dǎo)致CL源和QD生物分布間的不匹配。可在QD內(nèi)摻雜CL源制成自發(fā)光64Cu-CdSe/ZnS納米探針，用于荷瘤模型正電子發(fā)射斷層(PET)-CRRET雙模式顯像。基于QD在某些實(shí)體瘤中具有高通透性和滯留效應(yīng)(EPR)，64Cu-CdSe/ZnS探針可被動(dòng)靶向腫瘤組織而被高攝取[8]。為克服QD納米探針潛在毒性的缺陷，Guo等[37]制成了低毒性QD納米探針64Cu-CuInS/ZnS，用于荷瘤模型CRRETI，取得了預(yù)期效果。為提高QD探針的特異性，Li等[38]制備了靶向整合素受體多功能蛋白質(zhì)微球(MS)探針64Cu-QD-MS-cRGD，已成功用于動(dòng)物動(dòng)脈粥樣硬化斑PET和CRRETI顯像。為了研制高性能、低毒和良好生物相溶性的RRETI探針，近紅外放射性谷胱甘肽包被金納米粒(GS-198Au-AuNPs)[39]、放射發(fā)光198Au摻雜金納米籠(198Au-AuNCs)[40]和自發(fā)光64Cu摻雜金納米團(tuán)簇(64Cu-AuNCs)[41]已研制成功，并用于活體動(dòng)物和荷瘤動(dòng)物模型PET(或SPECT)和CR-RETI雙模式顯像，荷瘤組織表現(xiàn)良好金納米探針攝取。稀土納米粒也已經(jīng)用于RETI。Sun等[32]制備了油酸包被Ba0.55Y0.3F2:Eu3+和PEG包被Ba0.55Y0.3F2:Eu3+納米探針，以X射線為能量供體和Eu3+熒光納米探針為能量受體，構(gòu)建了X射線輻射致發(fā)光成像，已用于荷瘤模型X-RLI。另外，以18F-FDG為能量供體和Eu3+熒光納米探針為能量受體，首次建立了18F-FDG激發(fā)Eu3+熒光顯像方法，實(shí)現(xiàn)了荷瘤模型內(nèi)照射共振能量轉(zhuǎn)移顯像。Hu等[35]在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)和構(gòu)建了放射性藥物(18F-FDG)激發(fā)Eu3+熒光顯像方法，成功完成了荷瘤模型PET和RRET雙模式顯像。但該方法利用的是18F-FDG和氧化銪(EO)納米粒混合探針，實(shí)用性有限。Zhan等[34]設(shè)計(jì)合成了89Zr-Gd2O2S:Eu@PEG納米探針，以89Zr為能量供體和Gd2O2S:Eu為能量受體，建立了γ-射線輻射致發(fā)光成像，成功實(shí)現(xiàn)淋巴結(jié)定位PET和GR-RLI雙模式顯像。切倫科夫發(fā)光納米粒猝滅劑也可用于腫瘤PET和CRRETI雙模式顯像[42]，進(jìn)一步豐富了內(nèi)照射共振能量轉(zhuǎn)移顯像理論。

3 小結(jié)與展望

共振能量轉(zhuǎn)移分子顯像是分子顯像研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。與傳統(tǒng)OI比較，可顯著提高OI光信號(hào)強(qiáng)度和組織穿透能力，從而可對(duì)一定的深度組織實(shí)現(xiàn)分子顯像，并在生物功能大分子間相互作用研究以及分子顯像導(dǎo)向治療的可視化精準(zhǔn)診療方面發(fā)揮獨(dú)特作用。但是，F(xiàn)RETI需要外部射線或光源激發(fā)，而BRETI、CRETI和RRETI可彌補(bǔ)FRETI不足。BRETI和CRETI也具有一定局限性，其探針系統(tǒng)相對(duì)較為復(fù)雜，BRETI的能量受體需要結(jié)合或修飾發(fā)光酶，CRETI的能量受體需要結(jié)合或修飾化學(xué)發(fā)光底物。雖然RRETI涉及放射性，但是最有潛力轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的較為簡(jiǎn)單的RETI技術(shù)，且可實(shí)現(xiàn)核醫(yī)學(xué)和光學(xué)雙模式分子顯像。目前，以124I和Cy5-C dots分別作為能量供體和能量受體，構(gòu)建了124I標(biāo)記含染料Cy5超微無機(jī)雜交C點(diǎn)納米探針124I-cRGDY-PEG-C dots，已用于腫瘤患者PET和光學(xué)雙模式分子顯像，顯示出較好的臨床應(yīng)用前景[43]。該工作的完成為相關(guān)RETI臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

光信號(hào)強(qiáng)度、組織穿透性和納米探針毒性是制約RETI發(fā)展和臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。目前，F(xiàn)RETI外部激發(fā)源的選擇多樣性和新型供體染料的發(fā)展，BRETI新型能量供體發(fā)光酶和CRETI新型供體化學(xué)發(fā)光底物的研制，以及RRETI多種優(yōu)良特性的放射性核素和放射性藥物[44]的選擇和利用，為提高RETI光信號(hào)強(qiáng)度和組織穿透性提供了重要保障。另外，RETI使用的能量受體大多數(shù)為納米材料，隨著新型有機(jī)染料、低毒QD、AuNPs、石墨烯和稀土金屬等納米材料的出現(xiàn)和發(fā)展，有望研發(fā)出較為理想的能量受體以及低毒性、良好光信號(hào)強(qiáng)度和組織穿透性的新型納米探針，加快RETI的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

共振能量轉(zhuǎn)化分子顯像是RETI發(fā)展的必然趨勢(shì)。光聲成像(PAI)是一種在脈沖激光照射下由光能轉(zhuǎn)化為熱能再轉(zhuǎn)化為機(jī)械能并激發(fā)產(chǎn)生光聲信號(hào)的共振能量轉(zhuǎn)化分子顯像技術(shù)，可顯著改善RETI的光信號(hào)強(qiáng)度和組織穿透性，是目前分子影像學(xué)最前沿研究領(lǐng)域之一，已用于腫瘤早期檢測(cè)和治療監(jiān)控研究[45]。但PAI需要外部脈沖激光源的激發(fā)，研發(fā)內(nèi)部源激發(fā)的新型共振能量轉(zhuǎn)化分子顯像具有廣闊的發(fā)展前景。

[1] Liu X, Qiu J. Recent advances in energy transfer in bulk and nanoscale luminescent materials: from spectroscopy to applications[J]. Chem Soc Rev, 2015, 44: 8 714-8 746.

[2] So M K, Xu C, Loening A M, et al. Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging[J]. Nat Biotech, 2006, 24(3): 339-343.

[3] Zhang N, Francis K P, Prakash A, et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles[J]. Nat Med, 2013, 19(4): 500-505.

[4] Li P, Liu L, Xiao H, et al. A new polymer nanoprobe based on chemiluminescence resonance energy transfer for ultrasensitive imaging of intrinsic superoxide anion in mice[J]. J Am Chem Soc, 2016, 138: 2 893-2 896.

[5] Geiβler D, Hildebrandt N. Recent developments in forster resonance energy transfer (FRET) diagnostics using quantum dots[J]. Anal Bioanal Chem, 2016, 408(17): 4 475-4 483.

[6] Chou K F, Dennis A M. Forster resonance energy transfer between quantum dot donors and quantum dot acceptors[J]. Sensors, 2015, 15: 13 288-13 325.

[7] Shamirian A, Ghai A, Snee P T. QD-Based FRET Probes at a Glance[J]. Sensors, 2015, 15: 13 028-13 051.

[8] Sun X, Huang X, Guo J, et al. Self-illuminating64Cu-doped CdSe/ZnS nanocrystals for in vivo tumor imaging[J]. J Am Chem Soc, 2014, 136: 1 706-1 709.

[9] Hu H, Huang P, Weiss O J, et al. PET and NIR optical imaging using self-illuminating64Cu-doped chelator-free gold nanoclusters[J]. Biomaterials, 2014, 35: 9 868-9 876.

[10]Dothager R S, Goiffon R J, Jackson E, et al. Cerenkov radiation energy transfer (CRET) imaging: A novel method for optical imaging of PET isotopes in biological systems[J]. PLoS ONE, 2010, 5(10): e13 300.

[11]Axelsson J, Davis S C, Gladstone D J, et al. Cerenkov emission induced by external beam radiation stimulates molecular fluorescence[J]. Med Phys, 2011, 38(7): 4 127-4 132.

[12]Alvarez-Curto E, Pediani J D, Milligan G. Applications of fluorescence and bioluminescence resonance energy transfer to drug discovery at G protein coupled receptors[J]. Anal Bioanal Chem, 2010, 398: 167-180.

[13]Liu X, Qiu J. Recent advances in energy transfer in bulk and nanoscale luminescent materials: from spectroscopy to applications[J]. Chem Soc Rev, 2015, 44: 8 714-8 746.

[14]Peng H Q, Niu L Y, Chen Y Z, et al. Biological applications of supramolecular assemblies designed for excitation energy transfer[J]. Chem Rev, 2015, 115: 7 502-7 542.

[15]張順超, 沈國勵(lì),李合松. 共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用研究新進(jìn)展[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào),2015,31(4):560-566.

Zhang Shunchao, Shen Guoli, Li Hesong. Recent advances of application and study on resonance energy transfer technology in life science[J]. J Analyt Sci, 2015, 31(4): 560-566(in Chinese).

[16]Bouccara S, Sitbon G, Fragola A, et al. Enhancing fluorescence in vivo imaging using inorganic nanoprobes[J]. Curr Opinion Biotech, 2015, 34: 65-72.

[17]Zou P, Chen H, Paholak H J,et al. Noninvasive fluorescence resonance energy transfer imaging of in vivo premature drug release from polymeric nanoparticles[J]. Mol Pharmaceutics, 2013, 10: 4 185-4 194.

[18]Zhang R, Yang J, Radford D C, et al. FRET Imaging of enzyme-responsive HPMA copolymer conjugate[J]. Macromol Biosci, 2016, DOI: 10.1002/mabi.201600125.

[19]Bouchaala R, Mercier L, Andreiuk B, et al. Integrity of lipid nanocarriers in bloodstream and tumor quantified by near-infrared ratiometric FRET imaging in living mice[J]. J Control Release, 2016, 236: 57-67.

[20]Li X, Deng D, Xue J,et al. Quantum dots based molecular beacons for in vitro and in vivo detection of MMP-2 on tumor[J]. Biosens Bioelectron, 2014, 61: 512-518.

[21]Dragulescu-Andrasi A, Chana C T, Deb A, et al. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects[J]. PNAS, 2011, 108(29): 12 060-12 065.

[22]De A, Ray P, Loening A M, et al. BRET3: a red-shifted bioluminescence resonance energy transfer (BRET)-based integrated platform for imaging protein-protein interactions from single live cells and living animals[J]. FASEB J, 2009, 23: 2 702-2 709.

[23]Kamkaew A, Sun H, England C G,et al. Quantum dot-NanoLuc bioluminescence resonance energy transfer enables tumor imaging and lymph node mapping in vivo[J]. Chem Commun, 2016, 52: 6 997-7 000.

[24]Hsu C, Chen C, Yu H, et al. Bioluminescence resonance energy transfer using luciferase-immobilized quantum dots for self-illuminated photodynamic therapy[J]. Biomaterials, 2013, 34: 1 204-1 212.

[25]Shuhendler A J, Pu K, Cui L, et al. Real-time imaging of oxidative and nitrosative stress in the liver of live animals for drug-toxicity testing[J]. Nat Biotech, 2014, 32(4): 373-380.

[26]Zhen X, Zhang C, Xie C, et al. Intraparticle energy level alignment of semiconducting polymer nanoparticles to amplify chemiluminescence for ultrasensitive in vivo imaging of reactive oxygen species[J]. ACS Nano, 2016, 10: 6 400-6 409

[27]Li P, Liu L, Xiao H, et al. A new polymer nanoprobe based on chemiluminescence resonance energy transfer for ultrasensitive imaging of intrinsic superoxide anion in mice[J]. J Am Chem Soc, 2016, 138: 2 893-2 896.

[28]Huang X, Li L, Qian H, Dong C, Ren J. A resonance energy transfer between chemiluminescent donors and luminescent quantum-dots as acceptors (CRET)[J]. Angew Chem Int Ed, 2006, 45: 5 140-5 143.

[29]Zhang N, Francis K P, Prakash A, et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles[J]. Nat Med, 2013, 19(4): 500-505.

[30]Lee E S, Deepagan V G, You D G,et al. Nanoparticles based on quantum dots and a luminol derivative: implications for in vivo imaging of hydrogen peroxide by chemiluminescence resonance energy transfer[J]. Chem Commun, 2016, 52: 4 132-4 135.

[31]Naczynski D J, Sun C, Tuurkcan S, et al. X-ray-induced shortwave infrared biomedical imaging using rare-earth nanoprobes[J]. Nano Lett, 2015, 15: 96-102.

[32]Sun C, Pratx G, Carpenter C M, et al. Synthesis and radioluminescence of PEGylated Eu3+-doped nanophosphors as bioimaging probes[J]. Adv Mater, 2011, 23(24): 195-199.

[33]Liu H, Zhang X, Xing B, et al. Radiation-luminescence-excited quantum dots for in vivo multiplexed optical imaging[J]. Small, 2010, 6(10): 1 087-1 091.

[34]Zhan Y, Ai F, Chen F, et al. Intrinsically Zirconium-89 labeled Gd2O2S:Eu nanoprobes for in vivo positron emission tomography and gamma-ray-induced radioluminescence imaging[J]. Small, 2016, 12(21): 2 872-2 876.

[35]Hu Z, Qu Y, Wang K, et al. In vivo nanoparticle-mediated radiopharmaceutical excited fluorescence molecular imaging[J]. Nat Commun, 2015, 6: 7 560.

[36]Boschi F, Spinelli A E. Quantum dots excitation using pure beta minus radioisotopes emitting Cerenkov radiation[J]. RSC Adv, 2012, 2(2): 11 049-11 052.

[37]Guo W, Sun X, Jacobson O, et al. Intrinsically radioactive [64Cu]CuInS/ZnS quantum dots for PET and optical imaging: improved radiochemical stability and controllable cerenkov luminescence[J]. ASC Nano, 2015, 9(1): 488-495.

[38]Li J, Dobrucki L W, Marjanovic M, et al. Enhancement and wavelength-shifted emission of Cerenkov luminescence using multifunctional microspheres[J]. Phys Med Biol, 2015, 60: 727-739.

[39]Zhou C, Hao G, Thomas P,et al. Near-infrared emitting radioactive gold nanoparticles with molecular pharmacokinetics[J]. Angew Chem Int Ed, 2012, 51: 10 118-10 122.

[40]Wang Y, Liu Y, Luehmann H, et al. Radioluminescent gold nanocages with controlled radioactivity for real-time in vivo imaging[J]. Nano Lett, 2013, 13: 581-585.

[41]Hu H, Huang P, Weiss O J, et al. PET and NIR optical imaging using self-illuminating64Cu-doped chelator-free gold nanoclusters[J]. Biomaterials, 2014, 35: 9 868-9 876.

[42]Thorek D L J, Das S, Jan Grimm J. Molecular imaging using nanoparticle quenchers of cerenkov luminescence[J]. Small, 2014, 10(18): 3 729-3 734.

[43]Phillips E, Penate-Medina O, Zanzonico P B, et al. Clinical translation of an ultrasmall inorganic optical-PET imaging nanoparticle probe[J]. Sci Transl Med, 2014, 6(260): 1-9.

[44]聶大紅,唐剛?cè)A. 腫瘤氨基酸代謝PET顯像研究進(jìn)展[J]. 同位素,2015,28(4):215-224.

Nie Dahong, Tang Ganghua. Research progress of amino acid metabolism PET imaging in tumor[J]. J Isot, 2015, 28(4): 215-224(in Chinese).

[45]Nie L, Chen X. Structural and functional photoacoustic molecular tomography aided by emerging contrast agents[J]. Chem Soc Rev, 2014, 43(20): 7 132-7 170.

Resonance Energy Transfer Molecular Imaging Application in Biomedicine

NIE Da-hong1,2, TANG Gang-hua1,3

(1.GuangdongEngineeringCenterforTranslationalApplicationsofRadiopharmaceuticals,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510080,China; 2.DepartmentofRadiotherapy,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510080,China;3.DepartmentofNuclearMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-SenUniversity,Guangzhou510080,China)

Resonance energy transfer molecular imaging (RETI) can markedly improve signal intensity and tissue penetrating capacity of optical imaging, and have huge potential application in the deep-tissue optical imaging in vivo. Resonance energy transfer (RET) is an energy transition from the donor to an acceptor that is in close proximity, including non-radiative resonance energy transfer and radiative resonance energy transfer. RETI is an optical imaging technology that is based on RET. RETI mainly contains fluorescence resonance energy transfer imaging (FRETI), bioluminescence resonance energy transfer imaging (BRETI), chemiluminescence resonance energy transfer imaging (CRETI), and radiative resonance energy transfer imaging (RRETI). RETI is the hot field of molecular imaging research and has been widely used in the fields of biology and medicine. This review mainly focuses on RETI principle and application in biomedicine.

resonance energy transfer imaging; fluorescence resonance energy transfer; bioluminescence resonance energy transfer; chemiluminescence resonance energy transfer; radiative resonance energy transfer

2016-07-13;

2016-08-09

R817.4

A

1000-7512(2016)04-0248-09

10.7538/tws.2016.29.04.0248